miR-135a和miR-183对3T3-L1前脂肪细胞分化及脂肪形成的调控作用研究

发布时间：2021-09-08 08:58

　　本论文旨在研究miRNA对脂肪细胞分化的影响,探讨miRNA调控脂肪细胞分化和脂肪形成的分子机制。我们以5月龄大白猪和梅山猪的背部脂肪组织为研究对象,分别构建背部脂肪组织的小RNA文库,应用高通量的Solexa测序技术和生物信息学分析软件鉴定大白猪和梅山猪背部脂肪组织的miRNAs,并进行差异表达和预测新的miRNAs等一系列分析。对这些差异表达的miRNAs进行了鉴定、靶基因预测和功能分析,从中筛选与脂肪细胞分化、脂肪形成和脂肪代谢潜在相关的miRNAs。预测分析结果发现miR-135a和miR-183可能通过调控经典的Wnt/β-catenin信号通路来影响脂肪的形成。据此,本研究通过合成寡核苷酸片段miRNA mimics和miRNA inhibitor分别模拟“功能获得”和“功能缺失”来研究miRNAs对3T3-L1脂肪细胞的甘油三酯含量和分化标记基因表达水平的影响,并通过双荧素酶报告基因检测、QPCR及Western blotting分析来证实预测的靶基因。最后,通过生物信息学软件对小鼠miR-183的侧翼序列进行预测、分离并克隆其核心启动子、ChiP-PCR试验证实GATA... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：139 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
中英文缩写对照表
第一章 文献综述
    1 引言
    2 脂肪形成概述
    3 WNT信号通路调控脂肪形成的研究进展
        3.1 WNT信号通路及信号转导
        3.2 WNT信号通路调控脂肪形成
    4 miRNA调控脂肪细胞分化的研究进展
        4.1 miRNA的发现、生物合成及作用机制
        4.2 miRNA参与调控脂肪细胞的分化过程
    5 miRNA调控WNT信号通路影响脂肪形成的研究进展
    6 miRNA的转录调控
    7 目的与意义
第二章 猪背部皮下脂肪组织小RNA文库的构建及Solexa测序
    前言
    1 材料与方法
        1.1 试验动物以及样品采集
        1.2 主要试剂和仪器
        1.3 组织总RNA的提取
        1.4 小RNA文库的构建、Solexa高通量测序及数据分析
            1.4.1 试验流程
            1.4.2 信息分析流程
            1.4.3 初级生物信息学分析
            1.4.4 高级生物信息学分析
    2 结果与分析
        2.1 总RNA样品的质量检测结果
        2.2 Solexa高通量测序结果的生物信息学分析
            2.2.1 大白猪和梅山猪小RNA库的测序结果数据统计
            2.2.2 小RNA的分类注释
            2.2.3 已知miRNAs的表达量分析
            2.2.4 miRNA“种子”序列的碱基编辑
            2.2.5 猪新的候选miRNA的鉴定分析和mirna基因的聚类分析
    3 讨论
    4 小结
第三章 猪背部皮下脂肪组织miRNA的表达分析及功能预测
    前言
    1 材料与方法
        1.1 试验动物以及样品采集
        1.2 主要试剂和仪器
        1.3 引物的设计与合成
        1.4 组织总RNA的提取
        1.5 RNA的反转录
            1.5.1 cDNA第一链的合成
            1.5.2 普通PCR反应
            1.5.3 琼脂糖凝胶电泳和成像
        1.6 Stem-loop QPCR验证
        1.7 统计学分析
        1.8 miRNA的靶基因预测及功能分析
    2 结果与分析
        2.1 普通PCR和stem-loop QPCR验证结果
        2.2 miRNA的靶基因预测及功能分析
    3 讨论
    4 小结
第四章 miR-135a和miR-183对3T3-L1前脂肪细胞分化及脂肪形成的影响
    前言
    1 材料与方法
        1.1 主要试剂和仪器
        1.2 主要溶液的配制
        1.3 miR-135a和miR-183寡核苷酸的转染及3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化
        1.4 细胞总RNA的提取
        1.5 QPCR分析
        1.6 油红O染色及吸光度值分析
        1.7 甘油三酯含量测定
        1.8 预测靶基因3'UTR载体及其突变载体的构建
        1.9 靶基因的鉴定
        1.10 经典WNT信号通路相关基因及蛋白质的检测
        1.11 Western blotting分析
        1.12 统计学分析
    2 结果与分析
        2.1 miR-135a对3T3-L1前脂肪细胞分化及脂肪形成的影响
            2.1.1 miR-135a在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中下调表达
            2.1.2 超表达miR-135a抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化
            2.1.3 miR-135a靶基因的鉴定及其潜在调控机制
        2.2 miR-183对3T3-L1前脂肪细胞分化及脂肪形成的影响
            2.2.1 miR-183促进3T3-L1前脂肪细胞的分化
            2.2.2 miR-183靶基因的鉴定及其潜在调控机制
    3 讨论
    4 小结
第五章 小鼠mir-183启动子的转录活性研究
    前言
    1 材料与方法
        1.1 主要试剂及仪器
        1.2 生物信息学分析
        1.3 启动子片段的扩增及载体构建
        1.4 细胞转染
        1.5 细胞总RNA的提取、反转录、QPCR及Western blotting分析
        1.6 ChIP-PCR验证转录因子GATA3与mir-183启动子的结合
        1.7 统计学分析
    2 结果与分析
        2.1 mmu-mir-183转录规律的预测
        2.2 mmu-mir-183启动子区域载体构建及荧光活性分析
        2.3 mmu-mir-183 promoter 2缺失片段载体构建及荧光活性分析
        2.4 mmu-mir-183核心启动子转录因子的结合预测及其试验验证
        2.5 转录因子GATA3对成熟miR-183表达量的影响及其机制研究
    3 讨论
    4 小结
主要创新点
进一步的研究内容
参考文献
在读期间发表论文题录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]脂肪细胞分化相关miRNA-hsa-miR-378生物信息学分析[J]. 徐露莲,史春梅,陈玲,季晨博,郭锡熔,徐美玉.  中国儿童保健杂志. 2012(11)
[2]猪前体脂肪细胞的分离培养[J]. 张国华,杨公社,屈长青,孙世铎.  细胞生物学杂志. 2005(06)
[3]猪前体脂肪细胞的原代培养[J]. 屈长青,张国华,陈粉粉,赵丽丽,杨公社.  农业生物技术学报. 2005(05)

博士论文
[1]宰前应激对猪肉质的影响及其机制研究[D]. 柴进.华中农业大学 2010

硕士论文
[1]miR-196a对猪脂肪细胞增殖分化的影响[D]. 宁小敏.西北农林科技大学 2010



本文编号：3390503