猪温病毒结构蛋白E0基因打靶奶山羊的制备

发布时间：2017-05-01 15:12

  本文关键词：猪瘟病毒结构蛋白E0基因打靶奶山羊的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一种流行范围广、高度接触性的烈性传染病,是威胁养猪业的主要传染病之一。就现阶段而言,我国并未完全掌握彻底消灭猪瘟的方法。我国控制猪瘟病毒主要是采用传统疫苗。但由于猪瘟的流行形式发生了很大变化,已经不能对猪瘟起到很好的保护,因此,研究新型基因工程疫苗为大势所趋。猪瘟病毒结构蛋白E0(Classical swine fever virus,CSFV E0)可诱导机体产生中和抗体,从而使机体产生免疫。编码CSFV E0蛋白的核苷酸序列保守性相当高,因此CSFV E0蛋白可当成一种靶蛋白来防治猪瘟。本文利用TALEN基因打靶技术将含有猪瘟病毒结构蛋白E0基因的打靶载体定点整合到山羊β-乳球蛋白第一外显子中。在山羊乳腺上皮细胞中验证,其能够诱导表达猪瘟E0结构蛋白,这为以转CSFV E0基因的克隆细胞为供核细胞,进行核移植和胚胎移植来制备高效表达猪瘟病毒结构蛋白基因E0的山羊乳腺生物反应器奠定了基础。研究内容如下:1.CSFV E0基因在乳腺上皮细胞中的表达利用脂质体转染的方法将实验室构建的针对山羊β-乳球蛋白基因第一外显子的TALENs表达载体和包含CSFV E0基因的打靶载体共转染山羊乳腺上皮细胞,用药物(G418)进行筛选获得单克隆,并对获得的克隆进行5'端和3'端鉴定,鉴定都为阳性的克隆进行激素诱导24小时后,收集培养液和细胞。定量PCR和Western blot技术检测证明,转基因阳性细胞能够表达并分泌出CSFV E0蛋白。2.制备含有CSFV E0基因的打靶奶山羊应用电转染的方法将实验室构建的针对山羊β-乳球蛋白基因第一外显子的TALENs表达载体和含有CSFV E0基因的打靶载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,用药物(G418)进行筛选获得单克隆,并通过5'端和3'端PCR的检测,鉴定猪瘟结构蛋白E0基因定点整合到山羊β-乳球蛋白基因中的预期位点,并选取形态良好的克隆细胞株,运用体细胞核移植技术制备含有CSFV E0基因的克隆胚胎,共构建了138枚克隆胚胎,移植6只受体山羊,每只20-25枚克隆胚胎,并获得转基因山羊一只,经5'端和3'端PCR的检测,是含有CSFV E0基因的打靶山羊。综上所述,本文利用TALENs编辑技术使CSFV E0基因定点整合到山羊β-乳球蛋白第一外显子内,并结合体细胞移植和胚胎移植技术制备含有CSFV E0基因的乳腺生物反应器,使山羊乳腺分泌表达CSFV E0蛋白,为制备CSFV E0基因工程疫苗奠定基础。
【关键词】：猪瘟病毒结构蛋白E0 TALEN基因打靶技术 山羊乳腺上皮细胞 胎儿成纤维细胞 乳腺生物反应器
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651;Q78
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 文献综述12-24
• 1.1 猪瘟12-19
• 1.1.1 猪瘟的概述12-17
• 1.1.2 猪瘟的防控措施17-19
• 1.2 乳腺生物反应器19-20
• 1.2.1 乳腺生物反应器的概念19
• 1.2.2 乳腺生物反应器的研究进展19-20
• 1.3 基因编辑技术20-24
• 1.3.1 锌指核酸酶20-21
• 1.3.2 转录激活因子样效应物核酸酶21-22
• 1.3.3 RNA介导的工程核酸酶22-24
• 第二章 利用TALEN介导猪瘟病毒结构蛋白E0基因在乳腺上皮细胞中表达24-36
• 2.1 实验材料24-25
• 2.1.1 载体及菌株24-25
• 2.1.2 实验试剂25
• 2.2 实验方法25-30
• 2.2.1 乳腺上皮细胞的分离培养25-26
• 2.2.2 细胞的转染与单克隆阳性细胞的筛选26
• 2.2.3 单克隆细胞中猪瘟E0（CSFV E0）基因整合位点的检测26-27
• 2.2.4 猪瘟病毒E0(CSFV E0)基因表达的PCR检测27-28
• 2.2.5 猪瘟病毒E0(CSFV E0)基因表达的定量PCR检测28-29
• 2.2.6 猪瘟病毒E0(CSFV E0)蛋白分泌表达检测29-30
• 2.3 实验结果30-34
• 2.3.1 山羊乳腺上皮细胞的分离纯化30-31
• 2.3.2 外源基因整合位点的检测31-32
• 2.3.3 PCR检测猪瘟病毒EO基因32-33
• 2.3.4 猪瘟病毒E0基因表达水平的检测33-34
• 2.4 讨论34-35
• 2.5 小结35-36
• 第三章 转猪瘟病毒E0基因打靶奶山羊的制备36-45
• 3.1 实验材料36
• 3.1.1 载体及细胞36
• 3.1.2 实验试剂36
• 3.2 实验方法36-40
• 3.2.1 组织块法培养山羊胎儿成纤维细胞及其冻存36-37
• 3.2.2 胎儿成纤维细胞的转染及克隆的筛选37-38
• 3.2.3 猪瘟E0基因在胎儿成纤维细胞中的整合检测38
• 3.2.4 转基因克隆胚的移植38-39
• 3.2.5 受体山羊的妊娠检测39
• 3.2.6 转基因小羊PCR鉴定39-40
• 3.3 实验结果40-43
• 3.3.1 山羊胎儿成纤维细胞的组织块培养及克隆的形成40
• 3.3.2 猪瘟病毒E0基因在胎儿成纤维细胞中的PCR鉴定40-42
• 3.3.3 转基因克隆胚胎的移植及检测42-43
• 3.3.4 转基因小羊PCR鉴定43
• 3.4 讨论43-44
• 3.5 小结44-45
• 全文结论45-46
• 参考文献46-57
• 附录57-58
• 致谢58-59
• 作者简介59

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