FHL2基因在鸡骨骼肌卫星细胞增殖与分化中的作用研究

发布时间：2017-05-02 01:00

  本文关键词：FHL2基因在鸡骨骼肌卫星细胞增殖与分化中的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：FHL2 (Four and a Half LIM protein 2)属于FHL蛋白家族的成员,是一种只含有四个半LIM结构域的蛋白质。已有研究表明,FHL2直接或间接参与调控卫星细胞增值与分化相关重要通路(Wnt/β-catenin, TGFβ)的信号转导过程,且该基因在鸡出生后不同阶段的胸肌中表达呈现显著差异,推测FHL2基因可能为调控鸡骨骼肌卫星细胞增殖分化的重要因子。因此,本研究通过对体外培养的原代鸡胸肌卫星细胞进行FHL2 SiRNA的转染处理,观察对转染不同时间点(12h、24h、48h和72h)的肌卫星细胞增增与分化形态,并通过RT-PCR技术检测转染后(12h、24h和48h)相关成肌调节因子以及Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三条重要信号转导通路中关键基因的1mRNA表达,以及采用Western-Blot检测了FHL2、MYH7B以及NUMB蛋白在转染后(24h、48h和72h)的蛋白表达情况。结果表明：(1)细胞形态学变化：转染后12h,三个试验组细胞在形态学上没有明显的差异；24h后,处理组的卫星细胞数量明显少于两个对照组,对照组细胞极少部分出现分化；48h后,两个对照组细胞长满且大量分化,而处理组细胞少量增殖且仅有极少数细胞开始分化；72h后,两个对照组完全分化且出现肌管,而处理组的细胞数量无明显变化,部分细胞开始分化,但无肌管出现。(2)成肌调节因子的mRNA表达：在转染12h和24h后,处理组中FHL2的mRNA表达显著低于两个对照组(P0.05)；转染后12h,处理组中成肌调节因子MyoD和MyoG的mRNA表达量显著低于两个对照组(P0.05)；转染后24h,处理组中MyoG和MYHC的mRNA表达量显著低于两个对照组(P0.05)；三个试验组中MRF4的表达量在转染后的三个时间点均差异不显著(P0.05)(3) Notch信号通路：转染12h后,处理组中hairyl的1mRNA表达量显著低于空白对照组和阴性对照组(P0.05)；转染24h后,处理组中Notch2、Hey1以及hairy1的mRNA表达量显著或极显著低于对照组(P0.05或P0.01)；转染48h后,处理组中NUMB的mRNA表达量极显著低于另两个组(P0.01)；(4)TGFβ信号通路：关键基因ACVR1的mRNA表达量在转染12h时处理组显著低于两个对照组(P0.05); ACVR2的mRNA表达量则在转染后三个时间点中均为处理组显著低于两个对照组(P0.05)；(5)Wnt/β-catenin信号通路：转染12h后,处理组中β-catenin、Wnt2b以及Wnt4的mRNA表达量显著或极显著低于对照组(P0.05或P0.01)；转染24h后,处理组中Wnt4和Wnt6的mRNA表达量极显著低于对照组(P0.01)；转染48h后,处理组中GSK3β和Wnt5α的mRNA表达量极显著低于对照组(P0.01)。(6) Western-Blot检测表明：转染48h后,处理组中FHL2蛋白和MYH7B蛋白的表达量明显低于空白对照组和阴性对照组；在转染72h后,处理组中NUMB蛋白的表达量明显低于两个对照组。综上,转染FHL2 SiRNA后,鸡骨骼肌卫星细胞的增殖和分化均受到明显的抑制,FHL2的表达量降低下调部分成肌因子的表达,Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三条通路的信号转导也受到不同程度的抑制。因此,本研究推测FHL2基因可能通过Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三条通路的信号转导来调控鸡骨骼肌卫星细胞的增殖和分化,从而影响鸡肌肉的生长。
【关键词】：鸡 骨骼肌卫星细胞 FHL2基因 增殖分化 信号转导通路
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S831
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文缩写词(ABBREVIATIONS)10-13
• 1 文献综述13-27
• 1.1 卫星细胞与骨骼肌发育13-24
• 1.1.1 骨骼肌发育过程13-15
• 1.1.2 骨骼肌卫星细胞15-18
• 1.1.3 影响卫星细胞增殖分化的相关基因和信号通路18-24
• 1.2 FHL2与肌卫星细胞24-27
• 1.2.1 FHL2概述24-25
• 1.2.2 FHL2基因在骨骼肌发育和再生中的研究进展25-26
• 1.2.3 FHL2与肌卫星细胞增殖分化调控26-27
• 1.3 本试验的目的与意义27
• 2 材料与方法27-44
• 2.1 试验材料27-28
• 2.2 试验试剂与耗材28-30
• 2.2.1 荧光标记SIRNA28
• 2.2.2 主要试剂及试剂盒28-29
• 2.2.3 常用试剂的配制29
• 2.2.4 主要仪器设备29-30
• 2.2.5 主要应用的生物学软件30
• 2.3 试验方法30-44
• 2.3.1 CDNA模板的制备30-32
• 2.3.2 FHL2基因CDS区的获得以及不同组织中的表达情况分析32-35
• 2.3.3 细胞试验35-38
• 2.3.4 转染细胞荧光定量PCR38-40
• 2.3.5 转染细胞蛋白WESTERN BLOT40-44
• 2.3.6 数据统计分析44
• 3 结果与分析44-61
• 3.1 FHL2基因CDS区序列与不同组织中的表达情况44-47
• 3.1.1 FHL2基因CDS区序列44-45
• 3.1.2 FHL2基因在各组织中的表达45-47
• 3.2 鸡原代骨骼肌卫星细胞(SMSCS)形态学观察47-48
• 3.3 FHL2转染SIRNA位点的选取48-49
• 3.4 干扰FHL2对鸡骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响49-52
• 3.5 干扰FHL2对调控骨骼肌卫星细胞发育相关成肌调节因子及通路关键基因表达量的影响52-58
• 3.5.1 细胞转染后不同时间点FHL2基因表达量的变化52
• 3.5.2 干扰FHL2对卫星细胞中成肌调节因子的影响52-54
• 3.5.3 干扰FHL2对卫星细胞相关信号通路关键基因的影响54-58
• 3.6 干扰FHL2对部分卫星细胞分化相关基因蛋白表达量的影响58-61
• 4 讨论61-64
• 4.1 FHL2基因对鸡卫星细胞增殖与分化的影响61-63
• 4.1.1 FHL2基因在鸡体内各组织的表达61-62
• 4.1.2 FHL2基因对卫星细胞形态学的影响62
• 4.1.3 FHL2基因对卫星细胞增殖分化相关成肌调节因子的影响62-63
• 4.2 FHL2基因影响鸡卫星细胞增殖与分化的主要作用信号通路63-64
• 4.2.1 FHL2基因对WNT/B-CATENIN信号通路的调控63
• 4.2.2 FHL2基因对TGFB信号通路的调控63-64
• 4.2.3 FHL2基因对NOTCH信号通路的调控64
• 5 结论64-65
• 参考文献65-71
• 致谢71-72
• 攻读硕士研究生期间发表的论文和专利72

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