猪德尔塔冠状病毒NH株不同代次基因组特征和致病性分析
发布时间：2021-09-18 12:17
猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是近年来新出现的一种引起猪腹泻的冠状病毒。在2012年香港首次报道,2014年在美国猪群中检出并迅速蔓延至美国20多个州和加拿大。以水样腹泻、呕吐、脱水和死亡为主要临床症状,给养猪业造成了巨大经济损失。因此分离病毒并解析其在细胞传代过程中的基因进化特征和致病力差异将有助于PDCoV致弱的分子机制研究,对研制弱毒疫苗具有重大意义。本研究首先对PDCoV NH株在ST细胞传代毒株的病毒滴度和噬斑大小进行测定。结果表明随着传代次数增加,病毒滴度升高。低代次细胞毒产生的噬斑小,高代次细胞毒产生的噬斑大,NH株在细胞上传代50次后形成的噬斑大小无明显差异。利用19对引物对NH-P10、NH-P20、NH-P30、NH-P40、NH-P50、NH-P60、NH-P70、NH-P80、NH-P90、NH-P100、NH-P110、NHP120、NH-P130、NH-P140、NH-P150和NH-P160的全基因组进行测序。结果表明NH株在细胞传代过程中没有发生碱基的缺失和插入,但是存在核苷酸和氨基酸突变。这些核苷酸和氨...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PDCoV电镜照片
P140、NH-P150和NH-P160细胞毒稀释成10-1.0～10-9.0个稀释度。2）弃去96孔板中的维持液并用PBS洗2遍，甩干残液。3）每孔加入100μl稀释好的病毒液，每个稀释度做8个重复，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，每天观察结果。4）在显微镜下观察并记录不同稀释度下产生CPE的孔数，根据Reed-Muench方法计算不同代次的病毒滴度。2.3结果2.3.1全基因组分段扩增结果采用RT-PCR方法对NH株细胞传代毒每隔10代进行全基因组测序，每个代次获得了19个片段，且片段大小与理论值一致，以NH-P20和NH-P100为例（图2-1和图2-2）。图2-1PCR分段扩增NH-P20全基因电泳图Fig.2-1ElectrophoresisresultsofRT-PCRproductsofNH-P20completegenomesequenceM:2000bpMarker;F1-F19分别表示每对引物扩增片段LaneM:representsthe2000bpDNAladder;LaneF1-F19:representsthefragementamplifiedbyeachprimer,respectively
中国农业科学院硕士学位论文第二章PDCoV不同代次毒株的全基因组测序分析14图2-2PCR分段扩增NH-P100全基因电泳图Fig.2-2ElectrophoresisresultsofRT-PCRproductsofNH-P100completegenomesequenceM:2000bpMarker;F1-F19:分别表示每对引物扩增片段LaneM:representsthe2000bpDNAladder;F1-F19:representsthefragementamplifiedbyeachprimer,respectively2.3.2不同代次全基因组序列分析将用19对引物扩增并测序后的全基因组序列进行比对拼接后共获得关于NH株细胞传代毒的17个全基因组序列。NH分离株序列除去3’端的Poly（A）尾，全长25420bp。基因组的结构顺序为5’UTR-S-E-M-ORF5-N-ORF7-3’UTR，其中5’UTR的碱基数为540bp，ORF1碱基数为18803bp，S碱基数为3480bp，E碱基数为252bp，M碱基数为654bp，ORF5碱基数为285bp，N碱基数为1029bp，ORF7碱基数为603bp和3’UTR碱基数为392bp。不同代次细胞毒全基因组测序结果表明NH株在细胞传代过程中没有发生插入和缺失。2.3.3全基因组序列的遗传演化分析从Genbank下载了17个PDCoV毒株的全基因组序列，使用MEGA6.06软件中的NJ法对NH株进行系统发育分析。从图2-3可以看出中国PDCoV参考毒株在同一群内且亲缘关系近，而与美国，韩国，越南株不在同一群内且亲缘关系远。NH株与国内外参考株相比在5’UTR都有1个独特的核苷酸插入（150C151）。在19478-19480位连续3个核苷酸AAT缺失，这种缺失现象也出现在除PDCoVCHN/AH/2004和HKU15-44外的中国PDCoV毒株中,这可能是区分中国PDCoV毒株与其他国家PDCoV毒株的标志。NH株与其他参考株核苷酸比对发现全基因组中共有55个核苷酸为NH株特有。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于猪丁型冠状病毒重组S1蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用[J]. 侯林杉,贾敬亮,顾文源,刘宝京,师乾凯,袁广富,陈少杰,范京惠,左玉柱. 畜牧兽医学报. 2019(08)
[2]猪德尔塔冠状病毒纳米PCR检测方法的建立[J]. 董志珍,张霞,柴铭骏,陈小金,贾赟,肇慧君,帅江冰. 中国动物检疫. 2019(08)
[3]猪德尔塔冠状病毒重组聚合酶扩增检测方法的建立与应用[J]. 肖帅,刘新生,方玉珍,周鹏,张永光,王永录,魏彦明. 动物医学进展. 2019(03)
[4]A Highly Pathogenic Strain of Porcine Deltacoronavirus Caused Watery Diarrhea in Newborn Piglets[J]. Zhichao Xu,Huiling Zhong,Qingfeng Zhou,Yunping Du,Li Chen,Yun Zhang,Chunyi Xue,Yongchang Cao. Virologica Sinica. 2018(02)
[5]猪δ冠状病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 张利卫,曹贝贝,张云飞,张君涛,韦学雷,兰培英,胡慧. 农业生物技术学报. 2017(06)
[6]猪δ冠状病毒检测方法研究进展[J]. 龙云凤,王毅谦,姜珊,苏志同,李寒玲,吴绍强,姜焱. 畜牧与兽医. 2017(03)
[7]同时检测PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步应用[J]. 任玉鹏,张斌,汤承,曹恭貌,岳华. 中国兽医科学. 2016(06)
[8]猪δ冠状病毒的研究进展[J]. 方谱县,方六荣,董楠,肖少波. 病毒学报. 2016(02)
[9]国内首株猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus）的分离鉴定[J]. 陈建飞,王潇博,焦贺勋,时洪艳,张鑫,刘建波,石达,冯力. 中国预防兽医学报. 2016(03)
[10]SARS冠状病毒囊膜E蛋白的重组表达与单克隆抗体制备[J]. 王平,黄庆生,丁天兵,任君萍,宋建华,徐志凯. 生物技术通讯. 2005(05)
本文编号：3400124
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PDCoV电镜照片
P140、NH-P150和NH-P160细胞毒稀释成10-1.0～10-9.0个稀释度。2）弃去96孔板中的维持液并用PBS洗2遍，甩干残液。3）每孔加入100μl稀释好的病毒液，每个稀释度做8个重复，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，每天观察结果。4）在显微镜下观察并记录不同稀释度下产生CPE的孔数，根据Reed-Muench方法计算不同代次的病毒滴度。2.3结果2.3.1全基因组分段扩增结果采用RT-PCR方法对NH株细胞传代毒每隔10代进行全基因组测序，每个代次获得了19个片段，且片段大小与理论值一致，以NH-P20和NH-P100为例（图2-1和图2-2）。图2-1PCR分段扩增NH-P20全基因电泳图Fig.2-1ElectrophoresisresultsofRT-PCRproductsofNH-P20completegenomesequenceM:2000bpMarker;F1-F19分别表示每对引物扩增片段LaneM:representsthe2000bpDNAladder;LaneF1-F19:representsthefragementamplifiedbyeachprimer,respectively
中国农业科学院硕士学位论文第二章PDCoV不同代次毒株的全基因组测序分析14图2-2PCR分段扩增NH-P100全基因电泳图Fig.2-2ElectrophoresisresultsofRT-PCRproductsofNH-P100completegenomesequenceM:2000bpMarker;F1-F19:分别表示每对引物扩增片段LaneM:representsthe2000bpDNAladder;F1-F19:representsthefragementamplifiedbyeachprimer,respectively2.3.2不同代次全基因组序列分析将用19对引物扩增并测序后的全基因组序列进行比对拼接后共获得关于NH株细胞传代毒的17个全基因组序列。NH分离株序列除去3’端的Poly（A）尾，全长25420bp。基因组的结构顺序为5’UTR-S-E-M-ORF5-N-ORF7-3’UTR，其中5’UTR的碱基数为540bp，ORF1碱基数为18803bp，S碱基数为3480bp，E碱基数为252bp，M碱基数为654bp，ORF5碱基数为285bp，N碱基数为1029bp，ORF7碱基数为603bp和3’UTR碱基数为392bp。不同代次细胞毒全基因组测序结果表明NH株在细胞传代过程中没有发生插入和缺失。2.3.3全基因组序列的遗传演化分析从Genbank下载了17个PDCoV毒株的全基因组序列，使用MEGA6.06软件中的NJ法对NH株进行系统发育分析。从图2-3可以看出中国PDCoV参考毒株在同一群内且亲缘关系近，而与美国，韩国，越南株不在同一群内且亲缘关系远。NH株与国内外参考株相比在5’UTR都有1个独特的核苷酸插入（150C151）。在19478-19480位连续3个核苷酸AAT缺失，这种缺失现象也出现在除PDCoVCHN/AH/2004和HKU15-44外的中国PDCoV毒株中,这可能是区分中国PDCoV毒株与其他国家PDCoV毒株的标志。NH株与其他参考株核苷酸比对发现全基因组中共有55个核苷酸为NH株特有。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于猪丁型冠状病毒重组S1蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用[J]. 侯林杉,贾敬亮,顾文源,刘宝京,师乾凯,袁广富,陈少杰,范京惠,左玉柱. 畜牧兽医学报. 2019(08)
[2]猪德尔塔冠状病毒纳米PCR检测方法的建立[J]. 董志珍,张霞,柴铭骏,陈小金,贾赟,肇慧君,帅江冰. 中国动物检疫. 2019(08)
[3]猪德尔塔冠状病毒重组聚合酶扩增检测方法的建立与应用[J]. 肖帅,刘新生,方玉珍,周鹏,张永光,王永录,魏彦明. 动物医学进展. 2019(03)
[4]A Highly Pathogenic Strain of Porcine Deltacoronavirus Caused Watery Diarrhea in Newborn Piglets[J]. Zhichao Xu,Huiling Zhong,Qingfeng Zhou,Yunping Du,Li Chen,Yun Zhang,Chunyi Xue,Yongchang Cao. Virologica Sinica. 2018(02)
[5]猪δ冠状病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 张利卫,曹贝贝,张云飞,张君涛,韦学雷,兰培英,胡慧. 农业生物技术学报. 2017(06)
[6]猪δ冠状病毒检测方法研究进展[J]. 龙云凤,王毅谦,姜珊,苏志同,李寒玲,吴绍强,姜焱. 畜牧与兽医. 2017(03)
[7]同时检测PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步应用[J]. 任玉鹏,张斌,汤承,曹恭貌,岳华. 中国兽医科学. 2016(06)
[8]猪δ冠状病毒的研究进展[J]. 方谱县,方六荣,董楠,肖少波. 病毒学报. 2016(02)
[9]国内首株猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus）的分离鉴定[J]. 陈建飞,王潇博,焦贺勋,时洪艳,张鑫,刘建波,石达,冯力. 中国预防兽医学报. 2016(03)
[10]SARS冠状病毒囊膜E蛋白的重组表达与单克隆抗体制备[J]. 王平,黄庆生,丁天兵,任君萍,宋建华,徐志凯. 生物技术通讯. 2005(05)
本文编号：3400124
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