鸡沙门菌病抗体间接ELISA检测方法的建立

发布时间：2021-09-22 17:17

　　鸡沙门菌病在我国仍然广泛流行,严重危害养鸡业。外表健康的患鸡容易向外排菌,使鸡蛋、鸡肉等产品遭受污染,给食品安全和公众健康带来一定的危险,容易造成人食物中毒。由于沙门菌感染后能终身带菌,并可通过种蛋垂直传给雏鸡,因此鉴定并淘汰阳性种鸡十分必要。长期以来,养鸡场一直使用玻板凝集试验检测淘汰患鸡白痢、鸡伤寒的病鸡,但是该方法敏感性有限,经常漏检。感染鸡间歇性排毒或不排毒,使得传统分菌的方法不够敏感。感染性沙门菌血清型众多,传统ELISA方法不能满足实际需求。沙门菌InvJ蛋白是广泛存在于沙门菌中的保守蛋白,使用该蛋白检测沙门菌抗体,可以有效地检出被沙门菌感染的鸡。因此,本试验采用分子克隆方法,得到InvJ蛋白,将其作为检测抗原,研制出能检测沙门菌InvJ抗体的间接ELISA方法,现将结果报告如下。1.沙门菌InvJ基因的克隆与融合蛋白的表达同源性分析显示沙门菌InvJ蛋白和其他细菌的蛋白同源性低,在沙门菌中是一个保守蛋白。根据Genbank （CP003047）上公布的鸡伤寒／白痢沙门菌InvJ序列设计引物,成功在肠炎沙门菌标准株（CVCC3375）中扩增得到InvJ基因,将该基因连接到p... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：50 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
    1.1 沙门菌属简介
    1.2 沙门菌病及其流行情况
        1.2.1 人沙门菌病及其流行情况
        1.2.2 沙门菌对养鸡场的危害及流行情况
    1.3 沙门菌病的诊断方法
        1.3.1 常规分离鉴定病原的方法
        1.3.2 玻板凝集试验检测沙门菌抗体
        1.3.3 PCR技术检测检测沙门菌
        1.3.4 LAMP技术检测沙门菌
        1.3.5 免疫磁珠技术
        1.3.6 免疫层析技术
        1.3.7 ELISA方法检测沙门菌病
    1.4 沙门菌三型分泌系统结构、组成简介
    1.5 目的与意义
2 材料方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 菌株、质粒、血清
        2.1.2 仪器
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要溶液和培养基
    2.2 目的基因的选取及同源性分析
    2.3 目的基因的克隆与融合蛋白的表达
        2.3.1 目的基因的扩增
        2.3.2 重组质粒的构建
        2.3.3 重组质粒的鉴定
        2.3.4 重组蛋白表达产物的分析
        2.3.5 不同培养基、诱导剂对蛋白表达的影响
        2.3.6 重组蛋白的纯化
        2.3.7 Western-Blot鉴定融合蛋白免疫活性
    2.4 沙门菌InvJ抗体间接ELISA检测方法的建立
        2.4.1 重组抗原包被浓度及血清稀释度的确定
        2.4.2 最佳抗原包被液的确定
        2.4.3 封闭液的确定
        2.4.4 封闭时间的优化
        2.4.5 血清作用时间的优化
        2.4.6 酶标二抗作用时间的优化
        2.4.7 显色时间的优化
        2.4.8 阴性临界值的确定
    2.5 间接ELISA性能评价
        2.5.1 特异性试验
        2.5.2 重复性试验
    2.6 血清样品的初步检测
3 结果与分析
    3.1 蛋白选择及同源性分析
    3.2 基因的克隆与表达
        3.2.1 目的基因的扩增
        3.2.2 重组质粒的鉴定
        3.2.3 重组蛋白表达产物的分析
        3.2.4 不同培养基、诱导剂对蛋白表达的影响
        3.2.5 重组蛋白的纯化
        3.2.6 Western-Blot鉴定融合蛋白免疫活性
    3.3 沙门菌InvJ抗体间接ELISA检测方法的建立
        3.3.1 重组抗原包被浓度和血清稀释度的确定
        3.3.2 最佳抗原包被液的确定
        3.3.3 包被时间的确定
        3.3.4 封闭液的选择
        3.3.5 封闭时间的优化
        3.3.6 血清作用时间的优化
        3.3.7 最佳血清稀释液的选择
        3.3.8 酶标二抗作用时间的优化
        3.3.9 显色时间的优化
        3.3.10 间接ELISA操作方法的确定
        3.3.11 阴性临界值的确定
    3.4 间接ELISA可靠性试验
        3.4.1 特异性试验
        3.4.2 重复性试验
    3.5 血清样品的初步检测
4 讨论
    4.1 目的蛋白的选取
    4.2 融合蛋白的诱导表达
    4.4 间接ELISA检测沙门菌抗体
5 试验结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]合肥地区鸡沙门菌带菌情况调查及其血清型与基因型分析[J]. 刘军军,张宏海,方艳红,朱恒文,丁亮,李郁.  中国微生态学杂志. 2011(07)
[2]山西省鸡沙门氏菌病流行病学调查分析[J]. 薛俊龙,田林君,张国权,王国艳,张李俊,刘一飞.  山西农业科学. 2010(09)
[3]河南省鸡源沙门菌新近流行株的分离鉴定及其耐药性分析[J]. 廖成水,程相朝,吴庭才,张春杰,李银聚,王晓利,胡阿勇.  中国家禽. 2010(17)
[4]温度、pH、药物对大肠杆菌抑制作用的量热法研究[J]. 李向阳,邵卫华,刁恩杰,张洪林.  食品科学. 2007(06)
[5]内蒙古地区鸡沙门氏菌病流行病学调查[J]. 申之义,李利萍,张庆华,亢文华,李平安,关平原,张七斤,张仙保.  中国兽医杂志. 2001(09)
[6]单抗竞争EILSA试验及其在鸡白痢病检疫中的应用[J]. 焦新安,张如宽,刘秀梵.  中国畜禽传染病. 1990(05)
[7]鸡白痢系列净化措施的研究——Ⅲ.鸡白痢血检阳性鸡抗体消长情况的观察[J]. 张中直,陈福勇,甘孟侯,程锡麟.  中国兽医杂志. 1989(10)
[8]鸡白痢沙门氏菌脂多糖敏化红细胞在间接血凝试验中的应用[J]. 张如宽,甘军纪.  中国畜禽传染病. 1989(01)

硕士论文
[1]抗菌肽CAP18融合表达、条件优化以及活性的初步鉴定[D]. 徐灵龙.东北农业大学 2007



本文编号：3404103