PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的制备、诊断方法的建立及核酸疫苗研究
发布时间：2021-09-22 22:32
猪繁殖与呼吸综合征最早流行于美国,现在遍布全球,给全球的养殖业造成巨大损失,对该病的诊断与预防显得尤为重要。该病的诊断方法很多,主要分为抗原检测：PCR、实时荧光定量PCR;抗体检测：IFA、IPMA、SVN、EILSA。与其他方法做比较,ELISA方法更容易操作,用时短,敏感,适合用于进行流行病学调查和疫苗免疫效果的评价。接种疫苗是预防与控制该病的主要手段,目前用于预防PRRS的常用疫苗是弱毒苗和灭活苗。弱毒疫苗虽然能提供较好的免疫保护,但存在毒力返强的危险。灭活疫苗不仅需多次重复接种,而且效果不稳定,还经常导致免疫失败。目前迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。PRRSV ORF5基因翻译产生的GP5蛋白能诱导中和抗体的产生,在猪感染PRRSV后康复猪血清中的中和抗体主要作用GP5蛋白,因此GP5蛋白成为了PRRS新型疫苗和诊断试剂的较好靶蛋白。鉴于此,本课题研究了GP5蛋白的表达,针对GP5蛋白的单克隆抗体的制备,PRRSV GP5-ELISA诊断方法的建立,以及PRRSV核酸疫苗的研究。1.GP5蛋白在大肠杆菌中的高效表达由于全长ORF5基因在大肠杆菌中表达...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表（Abbreviation)
第1章 文献综述
1.1 猪繁殖与呼吸综合征
1.2 PRRSV病原特性
1.2.1 PRRSV的分类及形态
1.2.2 PRRSV的抗原性
1.3 PRRSV分子生物学研究进展
1.3.1 PRRSV基因组结构与功能
1.3.2 PRRSV的蛋白质
1.3.2.1 主要结构蛋白-GP5蛋白
1.4 PRRS诊断方法研究进展
1.4.1 病原学诊断
1.4.2 血清学诊断
1.5 PRRS疫苗研究进展
1.5.1 PRRS常规疫苗
1.5.2 PRRS新型疫苗
第2章 目的与意义
第3章 材料与方法
3.1 试验材料
3.1.1 细胞、毒株、菌株、实验动物
3.1.2 载体
3.1.3 工具酶及相关试剂
3.1.4 培养基、抗生素及其配制
3.1.5 相关缓冲液和试剂及其配制
3.1.6 其它试剂与缓冲液
3.1.7 血清
3.2 试验方法
3.2.1 细胞培养
3.2.2 病毒增值
3.2.3 总RNA的提取
3.2.4 限制性内切酶酶切反应
3.2.5 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.6 PCR产物或酶切产物回收与纯化
3.2.7 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.9 连接产物的转化
3.2.10 质粒的制备
3.2.11 质粒转染(脂质体介导转染法)
3.2.12 Western blot检测目的蛋白在真核细胞中的表达
3.2.13 包涵体提取
3.2.14 单抗的制备(徐志凯1992)
3.2.15 GP5-ELISA方法的建立
3.2.16 半数细胞培养物感染量(TCID_(50))的测定
3.2.17 微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)
3.2.18 细胞免疫的检测
3.2.19 动物试验
3.2.20 统计学方法
第4章 结果与分析
4.1 抗GP5蛋白的单克隆抗体的制备
4.1.1 PRRSV WUH3株的ORF5基因的RT-PCR扩增
4.1.2 GP5蛋白的原核表达质粒的构建和鉴定
4.1.3 GP5蛋白的原核表达与纯化
4.1.4 重组GP5蛋白最佳包被浓度的确定
4.1.5 免疫BALB/C小鼠血清效价的测定
4.1.6 Western Blotting验证抗GP5蛋白单克隆抗体
4.1.7 间接免疫荧光(IFA)验证抗GP5蛋白单克隆抗体
4.2 PRRSV GP5-ELISA诊断方法的建立
4.2.1 GP5-ELISA最佳条件的确定
4.2.2 GP5-ELISA阴阳界线的确定
4.2.3 GP5-ELISA方法的交叉反应性、重复性试验
4.2.4 GP5-ELISA与国外试剂盒的对比试验
4.3 PRRSV核酸疫苗的研究
4.3.1 真核质粒的构建
4.3.2 Western blot检测目的蛋白在Hela细胞中的表达
4.3.3 动物试验结果
第5章 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 针对GP5蛋白的单克隆抗体制备
5.1.2 PRRSV GP5-ELISA诊断方法的建立
5.1.3 PRRSV核酸疫苗的研究
5.2 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的研制[J]. 郭致君,王文泉,关智慧,金卫红. 当代畜牧. 2002(03)
[2]猪繁殖与呼吸综合征病毒形态学特征[J]. 李成,李六金,谷守林,蔡虹,姜焕宏,赵世君,张海,李秦. 畜牧兽医学报. 2001(06)
[3]猪繁殖与呼吸综合征及其在我国的现状与对策[J]. 蔡雪晖,柴文君,翁长江,刘光清,郭宝清. 中国预防兽医学报. 2000(S1)
[4]从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J]. 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙. 中国畜禽传染病. 1996(02)
硕士论文
[1]PRRSV病毒样颗粒的组装与DNA疫苗研究[D]. 李杨.华中农业大学 2012
[2]PRRSV GP5蛋白与猪IL-18基因共表达核酸疫苗的构建及免疫原性研究[D]. 高磊.吉林农业大学 2011
[3]PRRSV重组N蛋白ELISA检测方法的建立及单克隆抗体的制备[D]. 李素平.河南农业大学 2009
本文编号：3404495
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表（Abbreviation)
第1章 文献综述
1.1 猪繁殖与呼吸综合征
1.2 PRRSV病原特性
1.2.1 PRRSV的分类及形态
1.2.2 PRRSV的抗原性
1.3 PRRSV分子生物学研究进展
1.3.1 PRRSV基因组结构与功能
1.3.2 PRRSV的蛋白质
1.3.2.1 主要结构蛋白-GP5蛋白
1.4 PRRS诊断方法研究进展
1.4.1 病原学诊断
1.4.2 血清学诊断
1.5 PRRS疫苗研究进展
1.5.1 PRRS常规疫苗
1.5.2 PRRS新型疫苗
第2章 目的与意义
第3章 材料与方法
3.1 试验材料
3.1.1 细胞、毒株、菌株、实验动物
3.1.2 载体
3.1.3 工具酶及相关试剂
3.1.4 培养基、抗生素及其配制
3.1.5 相关缓冲液和试剂及其配制
3.1.6 其它试剂与缓冲液
3.1.7 血清
3.2 试验方法
3.2.1 细胞培养
3.2.2 病毒增值
3.2.3 总RNA的提取
3.2.4 限制性内切酶酶切反应
3.2.5 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.6 PCR产物或酶切产物回收与纯化
3.2.7 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.9 连接产物的转化
3.2.10 质粒的制备
3.2.11 质粒转染(脂质体介导转染法)
3.2.12 Western blot检测目的蛋白在真核细胞中的表达
3.2.13 包涵体提取
3.2.14 单抗的制备(徐志凯1992)
3.2.15 GP5-ELISA方法的建立
3.2.16 半数细胞培养物感染量(TCID_(50))的测定
3.2.17 微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)
3.2.18 细胞免疫的检测
3.2.19 动物试验
3.2.20 统计学方法
第4章 结果与分析
4.1 抗GP5蛋白的单克隆抗体的制备
4.1.1 PRRSV WUH3株的ORF5基因的RT-PCR扩增
4.1.2 GP5蛋白的原核表达质粒的构建和鉴定
4.1.3 GP5蛋白的原核表达与纯化
4.1.4 重组GP5蛋白最佳包被浓度的确定
4.1.5 免疫BALB/C小鼠血清效价的测定
4.1.6 Western Blotting验证抗GP5蛋白单克隆抗体
4.1.7 间接免疫荧光(IFA)验证抗GP5蛋白单克隆抗体
4.2 PRRSV GP5-ELISA诊断方法的建立
4.2.1 GP5-ELISA最佳条件的确定
4.2.2 GP5-ELISA阴阳界线的确定
4.2.3 GP5-ELISA方法的交叉反应性、重复性试验
4.2.4 GP5-ELISA与国外试剂盒的对比试验
4.3 PRRSV核酸疫苗的研究
4.3.1 真核质粒的构建
4.3.2 Western blot检测目的蛋白在Hela细胞中的表达
4.3.3 动物试验结果
第5章 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 针对GP5蛋白的单克隆抗体制备
5.1.2 PRRSV GP5-ELISA诊断方法的建立
5.1.3 PRRSV核酸疫苗的研究
5.2 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的研制[J]. 郭致君,王文泉,关智慧,金卫红. 当代畜牧. 2002(03)
[2]猪繁殖与呼吸综合征病毒形态学特征[J]. 李成,李六金,谷守林,蔡虹,姜焕宏,赵世君,张海,李秦. 畜牧兽医学报. 2001(06)
[3]猪繁殖与呼吸综合征及其在我国的现状与对策[J]. 蔡雪晖,柴文君,翁长江,刘光清,郭宝清. 中国预防兽医学报. 2000(S1)
[4]从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J]. 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙. 中国畜禽传染病. 1996(02)
硕士论文
[1]PRRSV病毒样颗粒的组装与DNA疫苗研究[D]. 李杨.华中农业大学 2012
[2]PRRSV GP5蛋白与猪IL-18基因共表达核酸疫苗的构建及免疫原性研究[D]. 高磊.吉林农业大学 2011
[3]PRRSV重组N蛋白ELISA检测方法的建立及单克隆抗体的制备[D]. 李素平.河南农业大学 2009
本文编号：3404495
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3404495.html
