口蹄疫病毒持续感染BHK-21细胞的转录调控研究

发布时间：2021-09-23 06:49

　　口蹄疫是一种针对偶蹄目家畜的、高度传染性的疾病,它的致病源口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）的基因组是一条8300nt左右的正义RNA分子。在家畜饲养中,口蹄疫往往是一种急性的、短期的感染,但是家畜免疫系统有时不能完全根除病毒,从而产生一种轻微的的、持续的感染现象,称之为持续感染。这种持续感染在一定条件下会引发大规模的急性感染。因此,研究口蹄疫病毒持续感染的机理对于疾病控制具有重要意义。本实验室利用氯化铵处理FMDV感染的BHK-21细胞（叙利亚亚仓鼠肾细胞）建立了体外持续感染细胞模型,命名为PI（persistent infections）细胞。对持续感染建立机制的初步研究表明,氯化铵更倾向于改变宿主细胞的的性状,使得BHK-21细胞更具有抵抗FMDV裂解性感染的能力,而病毒的裂解性感染能力并未改变。因此,要研究持续感染建立的机制,就必须从宿主细胞的角度出发。本研究首次运用跨物种杂交（CSH）芯片技术,将BHK-21细胞基因组转录物与人类全基因组表达谱芯片进行杂交。分别检测急性感染细胞和持续感染细胞的全基因组表达谱情况（相对于正常BHK... 

【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：122 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 口蹄疫病毒流行病学简介
        1.1.1 口蹄疫的历史及其影响
        1.1.2 口蹄疫病毒
        1.1.3 临床状况
        1.1.4 持续感染和亚临床感染
        1.1.5 口蹄疫病毒的进化和分子流行病学
    1.2 口蹄疫病毒持续感染的研究进展
        1.2.1 持续感染细胞的建立及机制的初步研究
        1.2.2 持续感染中病毒方面的研究进展
        1.2.3 持续感染中宿主细胞方面的研究进展
    1.3 交叉物种杂交(Cross-species hybridization,CSH)芯片技术
        1.3.1 简介
        1.3.2 目标物种和芯片平台之间的适用性
        1.3.3 CSH可以得到与SSH(种内特异杂交)似的结果吗?
        1.3.4 探针和转录物的匹配程度影响了CSH结果的质量
            1.3.4.1 CSH之中的信号降低
            1.3.4.2 CSH之中多余的交叉杂交
            1.3.4.3 CSH结果的重复性
        1.3.5 怎样从CSH中得到准确的生物学结果?
            1.3.5.1 选择芯片平台,评价候选芯片平台
            1.3.5.2 选择芯片探针类型
            1.3.5.3 实验设计
        1.3.6 小结
第二章 运用交叉物种杂交(CSH)芯片技术对FMDV持感细胞和急感细胞全基因组表达进行检测
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 方法
            2.2.2.1 细胞培养及病毒感染、滴度测定
            2.2.2.2 急感、持感和正常BHK-21细胞的总RNA提取
            2.2.2.3 病毒RNA的提取及其RT-PCR实时荧光定量
            2.2.2.4 总RNA质量检测及cDNA合成
            2.2.2.5 荧光标记cRNA合成
            2.2.2.6 芯片杂交、洗涤及扫描
    2.3 结果与分析
        2.3.1 野生FMDV滴度测定
            2.3.1.1 蚀斑法测定FMDV滴度
            2.3.1.2 TCID_(50)法测定FMDV滴度
        2.3.2 持感病毒与持感细胞的特性研究
            2.3.2.1 持感病毒形成CPE的能力
            2.3.2.2 持感细胞的抗病毒能力
        2.3.3 总RNA质量检测
        2.3.4 表达谱芯片扫描图片
        2.3.5 全基因组表达谱芯片数据
    2.4 讨论
第三章 表达谱芯片结果的深入分析及荧光定量验证
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 方法
            3.2.2.1 基因芯片数据分析
            3.2.2.2 急感、持感和正常BHK-21劝胞的样品收集与RNA提取
            3.2.2.3 RT-PCR实时荧光定量
            3.2.2.4 基因克隆及其测序
    3.3 结果与分析
        3.3.1 芯片结果的初步分析(所有信号点表达值的整体分析)
            3.3.1.1 Box Plot(箱线图分析基因表达的总体分布)
            3.3.1.2 MA Plot(双通道信号整体强度和差值)
            3.3.1.3 Heat Map and Unsupervised Hierarchical Clustering(层次聚类分析)
            3.3.1.4 总结
        3.3.2 急感和持感的显著差异表达基因的分析(相对于正常BHK-21细胞)
        3.3.3 Pathway分析
        3.3.4 找出共同变化的基因
        3.3.5 挑取基因进行荧光定量验证
        3.3.6 定量基因的克隆测序结果
    3.4 讨论
第四章 跨平台杂交(cross-platform hybridization)芯片技术对持续感染细胞的进一步研究
    4.1 引言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 方法
            4.2.2.1 急感、持感和正常BHK-21细胞的总RNA提取
            4.2.2.2 总RNA质量检测及cDNA合成
            4.2.2.3 荧光标记cRNA合成
            4.2.2.4 芯片杂交、洗涤及扫描
    4.3 结果与分析
        4.3.1 收样细胞以及总RNA质量检测
        4.3.2 表达谱芯片扫描图片
        4.3.3 全基因组表达谱芯片数据
        4.3.4 小鼠芯片检测结果的初步分析
            4.3.4.1 Box Plot(箱线图分析基因表达总体分布)
            4.3.4.2 MA Plot(双通道信号整体强度和差值)
            4.3.4.3 Heat Map and Unsupervised Hierarchical Clustering(层次聚类分析)
            4.3.4.4 总结
        4.3.5 小鼠芯片和人类芯片全基因组表达谱结果的比较
        4.3.6 找出小鼠和人类芯片结果中共有的基因
    4.4 讨论
全文总结
参考文献
博士在读期间发表和待发表的论文
致谢



本文编号：3405241