芽孢杆菌中新型非核糖体肽类抗菌活性物质的发掘、分离鉴定及特性研究
发布时间：2021-09-23 21:53
本研究旨在基于对细菌次级代谢产物的筛选,寻找新型非核糖体肽类抗菌物质。通过对烟台沿海地区的土壤、海水及近海常见海洋生物中的细菌进行培养,分离纯化得到细菌的单克隆,以大肠杆菌（E.coli） ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 29213为指示菌进行初步筛选,以耐多黏菌素和碳青霉烯E.coli B2 (blaNDM-5+mcr-1)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA） T144作为指示菌对有活性的细菌进行二次筛选。通过提取基因组进行PCR扩增产物测序比对,确定活性菌种属。采用有机萃取法对细菌的次级代谢产物进行萃取,通过凝胶层析和制备液相色谱进行纯化,利用分析型液相色谱进行纯度检测,进—步利用质谱对纯化后的抗菌活性物质进行结构鉴定。测序结果表明,活性菌属于解淀粉酶芽孢杆菌种,将其命名为解淀粉酶芽孢杆菌9-14（活性菌9-14）。抑菌试验结果表明,活性菌9-14的代谢产物对金黄色葡萄球菌ATCC 29213、MRSA T144、E.coli ATCC 25922和E.coli B2均具有高效抑制作用。活性菌9-14代谢产物是由氨基酸链组成的环状脂肽,属于伊枯...
【文章来源】：中国畜牧兽医. 2020,47(12)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
16S rRNA PCR扩增电泳图
采用分光光度法测定波长为600 nm时活性菌的D值,绘制其生长曲线,确定最佳产抗菌物质的时间。由图2可知,活性菌9-14在1～3 h内生长速度较慢,处于生长迟缓期,4～10 h生长速度较快,细菌大量繁殖,处于生长对数期,11～20 h内,生长都比较平缓,属于生长稳定期,20 h吸光度达到最大值,之后开始下降。细菌生长稳定期为获得细菌代谢产物的最佳时期,因此,活性菌9-14培养20 h为萃取代谢产物最佳时间。2.3 粗提物的分离纯化
由图6可知,4号(6.8～8 min)所对应的峰的洗脱液有抑菌活性。将4号洗脱液配制浓度为50 μg/mL,在4 ℃、12 000 r/min离心10 min后取上清,使用分析液相检测纯度。由图7可知,抗菌活性物质出峰时间为7.84 min,经过制备液相更加精细的纯化,活性物质的浓度能满足质谱鉴定的要求。图4 活性菌9-14粗提物凝胶过滤层析紫外吸收图谱
【参考文献】：
期刊论文
[1]兔奇异变形杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 王俊书,徐进强,金红岩,侯绍华,封家旺. 中国畜牧兽医. 2019(05)
[2]抗菌肽BSN-37的抑菌活性及其稳定性分析[J]. 张炜,杭柏林,司素锦,宁春妹,李杰,胡建和. 中国畜牧兽医. 2019(01)
[3]新型抗菌肽——表面活性素、伊枯草菌素和丰原素[J]. 金清,肖明. 微生物与感染. 2018(01)
[4]枯草芽孢杆菌HS-A38产抗菌脂肽Bacillomycin D的组分分析及鉴定[J]. 刘佳欣,丛丽娜,李成,董亮,张永吉,齐建权. 工业微生物. 2017(02)
[5]益生芽孢杆菌脂肽类抑菌成分的高效液相色谱-电喷雾串联质谱分析[J]. 李红亚,李术娜,王树香,王全,李文,朱宝成. 动物营养学报. 2017(04)
[6]基于16S rRNA基因测序法分析北京霾污染过程中PM2.5和PM10细菌群落特征[J]. 王步英,郎继东,张丽娜,方剑火,曹晨,郝吉明,朱听,田埂,蒋靖坤. 环境科学. 2015(08)
[7]1株广谱拮抗植物病原真菌的芽孢杆菌HNA3的鉴定及其活性成分分析[J]. 徐菱菱,王丽,陈龙男,谢福莉,李友国. 华中农业大学学报. 2013(03)
[8]水稻内生枯草芽孢杆菌G87抗菌蛋白的分离纯化及理化特性[J]. 陈夕军,李娟,孙启利,童蕴慧,徐敬友. 微生物学报. 2010(10)
[9]抗菌肽的研究现状与展望[J]. 韩文瑜,孙长江. 中国兽药杂志. 2009(10)
[10]Purification and characterization of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis strain B29[J]. Jing LI1,2, Qian YANG1, Li-hua ZHAO3, Shu-mei ZHANG2, Yu-xia WANG2, Xiao-yu ZHAO2 (1Department of Life Science and Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150001, China) (2Institute of Microbiology of Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin 150010, China) (3Heilongjiang University Press, Harbin 150040, China). Journal of Zhejiang University（Science B:An International Biomedicine & Biotechnology Journal）. 2009(04)
博士论文
[1]新型非核糖体肽类衍生物的发掘及其抗菌机制研究[D]. 刘源.中国农业大学 2018
硕士论文
[1]芽孢杆菌脂肽类抗生素多样性与罗克霉素合成酶启动子关键调控因子的初步研究[D]. 向亚萍.南京农业大学 2016
[2]枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌物质分离纯化及结构鉴定[D]. 居延娟.南京农业大学 2010
本文编号：3406485
【文章来源】：中国畜牧兽医. 2020,47(12)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
16S rRNA PCR扩增电泳图
采用分光光度法测定波长为600 nm时活性菌的D值,绘制其生长曲线,确定最佳产抗菌物质的时间。由图2可知,活性菌9-14在1～3 h内生长速度较慢,处于生长迟缓期,4～10 h生长速度较快,细菌大量繁殖,处于生长对数期,11～20 h内,生长都比较平缓,属于生长稳定期,20 h吸光度达到最大值,之后开始下降。细菌生长稳定期为获得细菌代谢产物的最佳时期,因此,活性菌9-14培养20 h为萃取代谢产物最佳时间。2.3 粗提物的分离纯化
由图6可知,4号(6.8～8 min)所对应的峰的洗脱液有抑菌活性。将4号洗脱液配制浓度为50 μg/mL,在4 ℃、12 000 r/min离心10 min后取上清,使用分析液相检测纯度。由图7可知,抗菌活性物质出峰时间为7.84 min,经过制备液相更加精细的纯化,活性物质的浓度能满足质谱鉴定的要求。图4 活性菌9-14粗提物凝胶过滤层析紫外吸收图谱
【参考文献】：
期刊论文
[1]兔奇异变形杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 王俊书,徐进强,金红岩,侯绍华,封家旺. 中国畜牧兽医. 2019(05)
[2]抗菌肽BSN-37的抑菌活性及其稳定性分析[J]. 张炜,杭柏林,司素锦,宁春妹,李杰,胡建和. 中国畜牧兽医. 2019(01)
[3]新型抗菌肽——表面活性素、伊枯草菌素和丰原素[J]. 金清,肖明. 微生物与感染. 2018(01)
[4]枯草芽孢杆菌HS-A38产抗菌脂肽Bacillomycin D的组分分析及鉴定[J]. 刘佳欣,丛丽娜,李成,董亮,张永吉,齐建权. 工业微生物. 2017(02)
[5]益生芽孢杆菌脂肽类抑菌成分的高效液相色谱-电喷雾串联质谱分析[J]. 李红亚,李术娜,王树香,王全,李文,朱宝成. 动物营养学报. 2017(04)
[6]基于16S rRNA基因测序法分析北京霾污染过程中PM2.5和PM10细菌群落特征[J]. 王步英,郎继东,张丽娜,方剑火,曹晨,郝吉明,朱听,田埂,蒋靖坤. 环境科学. 2015(08)
[7]1株广谱拮抗植物病原真菌的芽孢杆菌HNA3的鉴定及其活性成分分析[J]. 徐菱菱,王丽,陈龙男,谢福莉,李友国. 华中农业大学学报. 2013(03)
[8]水稻内生枯草芽孢杆菌G87抗菌蛋白的分离纯化及理化特性[J]. 陈夕军,李娟,孙启利,童蕴慧,徐敬友. 微生物学报. 2010(10)
[9]抗菌肽的研究现状与展望[J]. 韩文瑜,孙长江. 中国兽药杂志. 2009(10)
[10]Purification and characterization of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis strain B29[J]. Jing LI1,2, Qian YANG1, Li-hua ZHAO3, Shu-mei ZHANG2, Yu-xia WANG2, Xiao-yu ZHAO2 (1Department of Life Science and Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150001, China) (2Institute of Microbiology of Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin 150010, China) (3Heilongjiang University Press, Harbin 150040, China). Journal of Zhejiang University（Science B:An International Biomedicine & Biotechnology Journal）. 2009(04)
博士论文
[1]新型非核糖体肽类衍生物的发掘及其抗菌机制研究[D]. 刘源.中国农业大学 2018
硕士论文
[1]芽孢杆菌脂肽类抗生素多样性与罗克霉素合成酶启动子关键调控因子的初步研究[D]. 向亚萍.南京农业大学 2016
[2]枯草芽孢杆菌fmbJ抗菌物质分离纯化及结构鉴定[D]. 居延娟.南京农业大学 2010
本文编号：3406485
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