猪肺炎支原体FBA蛋白原核克隆表达、免疫原性及活性分析
发布时间：2021-09-30 18:15
果糖二磷酸醛缩酶（FBA）是多种疫苗和药物靶点,猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp）的强毒株和弱毒株的FBA的表达不同,故研究猪肺炎支原体FBA免疫特性对该病的防控有重要的意义。本试验用原核表达系统表达了Mhp蛋白果糖1,6-二磷酸-D-醛缩酶（FBA）蛋白,并应用该重组蛋白免疫小鼠,利用Mhp全菌蛋白和FBA蛋白作为包被抗原对小鼠血清进行ELISA检测,检测了FBA抗原性。根据GenBank公布的Mhp FBA基因序列,利用软件Primer5.0设计引物并合成,通过PCR扩增目的基因,测序发现864bp含有2个稀有密码子,我们对前段90bp进行基因合成,剩余778bp通过SOE-PCR方法突变连接起来,插入到表达载体pET-28a（+）中,构建重组表达质粒pET-28a（+）/FBA。将重组质粒pET-28a（+）/FBA导入大肠杆菌BL21（DE3）进行表达,经1%IPTG诱导表达5h后,蛋白的表达量最高,并用Protino Ni-TED2000Packed Columns进行亲和纯化,得到较纯的目的蛋白。Western-blot结果分析证实原...
【文章来源】：山西农业大学山西省
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组蛋白的表达及存在形式分析
按说明书使用His标签融合蛋白纯化柱对表达产物进行纯化，纯化后进行SDS-PAGE纯度分析，获得大小为35 kDa的纯蛋白，结果见图1-8。后将分离纯化重组蛋白进行半干式转印法转印至NC膜上，一抗为猪抗猪肺炎支原体髙免血清，二抗为羊抗猪IgG-HRP，DAB试剂盒显色，结果证实，该蛋白能与猪Mhp高免猪血清发生特异性反应，见图1-9。-24-
图1-8纯化后FBA蛋白SDS-PAGE 图1-9 FBA蛋白的Westem-blot结果M:蛋白质标准； M：预染的蛋白质标准；1 ：纯化后的FBA蛋白 1 ：纯化后的FBA蛋白Fig l-8,The purification result of Fig 1-9 The result of Westem-blotrecombinant protein FBA M： Pre-Protein molecular weight markerM: Protein molecular weight marker； i： protein FBA after purification1 ： protein FBA after purification4讨论当前国内外有关于果糖1,6-二憐酸醛缩酶的研究报道不太多，主要是关于疫苗、断及治疗等方面。ScottD.Pegan[46]等对结合分支杆菌的FBA蛋白进行了表达纯化，并
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡毒支原体醛缩酶的原核表达及膜定位鉴定[J]. 何随彬,谭磊,包世俊,郭小琴,仇旭升,宋翠萍,费荣梅,丁铲. 中国兽医科学. 2013(01)
[2]抗果糖二磷酸醛缩酶抗体检测对侵袭性念珠菌病的诊断价值[J]. 王颖,陆静芬,李芳秋,史利宁,黄梅,王卫萍,邵海枫. 现代检验医学杂志. 2012 (05)
[3]猪肺炎支原体DnaK基因的表达及ELISA方法建立[J]. 刘茂军,丁志勇,刘冬霞,杜海霞,缪芬芳,甘源,孔猛,冯志新,熊祺琰,白方方,杜改梅,邵国青. 金陵科技学院学报. 2011(04)
[4]猪肺炎支原体P36基因在毕赤酵母中的表达[J]. 祝永琴,刘茂军,冯志新,魏建超,曹瑞兵,周斌,陈溥言,邵国青. 江苏农业学报. 2011(02)
[5]猪肺炎支原体P36蛋白间接ELISA检测方法的建立[J]. 祝永琴,冯志新,刘茂军,吴叙苏,邵国青. 江苏农业学报. 2010(05)
[6]猪肺炎支原体不同毒力株黏附因子基因序列分析[J]. 刘茂军,邵国青,张映. 江苏农业学报. 2010(03)
[7]猪肺炎支原体P46基因特异性噬菌体随机肽库的构建[J]. 刘志宗,葛亚明,宁红梅,张映,聂向庭. 畜牧与兽医. 2009(10)
[8]猪呼吸道疾病综合症的发病机理与防控措施[J]. 张家恭. 养殖与饲料. 2008(09)
[9]猪肺炎霉形体热休克蛋白Hsp70单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 乔祖健,王亮,李媛,陈超,辛九庆,李继昌. 中国兽医科学. 2008(08)
[10]猪肺炎支原体中国分离株热休克蛋白Hsp70（Dnak）的全基因克隆及C末端基因的表达与免疫活性分析[J]. 李媛,张建华,王亮,乔祖建,辛九庆. 中国预防兽医学报. 2008(03)
硕士论文
[1]猪肺炎支原体168强弱毒株差异蛋白的筛选及鉴定[D]. 邱明君.山西农业大学 2013
[2]猪肺炎支原体P97 C末端蛋白抗原表位分析及抗原捕捉ELISA方法初步研究[D]. 张美晶.中国农业科学院 2010
本文编号：3416402
【文章来源】：山西农业大学山西省
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组蛋白的表达及存在形式分析
按说明书使用His标签融合蛋白纯化柱对表达产物进行纯化，纯化后进行SDS-PAGE纯度分析，获得大小为35 kDa的纯蛋白，结果见图1-8。后将分离纯化重组蛋白进行半干式转印法转印至NC膜上，一抗为猪抗猪肺炎支原体髙免血清，二抗为羊抗猪IgG-HRP，DAB试剂盒显色，结果证实，该蛋白能与猪Mhp高免猪血清发生特异性反应，见图1-9。-24-
图1-8纯化后FBA蛋白SDS-PAGE 图1-9 FBA蛋白的Westem-blot结果M:蛋白质标准； M：预染的蛋白质标准；1 ：纯化后的FBA蛋白 1 ：纯化后的FBA蛋白Fig l-8,The purification result of Fig 1-9 The result of Westem-blotrecombinant protein FBA M： Pre-Protein molecular weight markerM: Protein molecular weight marker； i： protein FBA after purification1 ： protein FBA after purification4讨论当前国内外有关于果糖1,6-二憐酸醛缩酶的研究报道不太多，主要是关于疫苗、断及治疗等方面。ScottD.Pegan[46]等对结合分支杆菌的FBA蛋白进行了表达纯化，并
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡毒支原体醛缩酶的原核表达及膜定位鉴定[J]. 何随彬,谭磊,包世俊,郭小琴,仇旭升,宋翠萍,费荣梅,丁铲. 中国兽医科学. 2013(01)
[2]抗果糖二磷酸醛缩酶抗体检测对侵袭性念珠菌病的诊断价值[J]. 王颖,陆静芬,李芳秋,史利宁,黄梅,王卫萍,邵海枫. 现代检验医学杂志. 2012 (05)
[3]猪肺炎支原体DnaK基因的表达及ELISA方法建立[J]. 刘茂军,丁志勇,刘冬霞,杜海霞,缪芬芳,甘源,孔猛,冯志新,熊祺琰,白方方,杜改梅,邵国青. 金陵科技学院学报. 2011(04)
[4]猪肺炎支原体P36基因在毕赤酵母中的表达[J]. 祝永琴,刘茂军,冯志新,魏建超,曹瑞兵,周斌,陈溥言,邵国青. 江苏农业学报. 2011(02)
[5]猪肺炎支原体P36蛋白间接ELISA检测方法的建立[J]. 祝永琴,冯志新,刘茂军,吴叙苏,邵国青. 江苏农业学报. 2010(05)
[6]猪肺炎支原体不同毒力株黏附因子基因序列分析[J]. 刘茂军,邵国青,张映. 江苏农业学报. 2010(03)
[7]猪肺炎支原体P46基因特异性噬菌体随机肽库的构建[J]. 刘志宗,葛亚明,宁红梅,张映,聂向庭. 畜牧与兽医. 2009(10)
[8]猪呼吸道疾病综合症的发病机理与防控措施[J]. 张家恭. 养殖与饲料. 2008(09)
[9]猪肺炎霉形体热休克蛋白Hsp70单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 乔祖健,王亮,李媛,陈超,辛九庆,李继昌. 中国兽医科学. 2008(08)
[10]猪肺炎支原体中国分离株热休克蛋白Hsp70（Dnak）的全基因克隆及C末端基因的表达与免疫活性分析[J]. 李媛,张建华,王亮,乔祖建,辛九庆. 中国预防兽医学报. 2008(03)
硕士论文
[1]猪肺炎支原体168强弱毒株差异蛋白的筛选及鉴定[D]. 邱明君.山西农业大学 2013
[2]猪肺炎支原体P97 C末端蛋白抗原表位分析及抗原捕捉ELISA方法初步研究[D]. 张美晶.中国农业科学院 2010
本文编号：3416402
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3416402.html
