基于肽段抗原的猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测方法的建立
发布时间：2021-10-05 05:56
众所周知,猪伪狂犬病毒病被定义为极难防疫的自然疫源性疾病,在全球范围内广泛传播,其中欧美一些国家已具备有效的疾病防控手段和扑杀程序,但在第三世界国家,仍无法对该病进行有效的防控。在我国,猪伪狂犬病疫情曾一度通过疫苗免疫的手段得到控制,但于2010年起,猪伪狂犬病病毒在我国发生了大范围的突变,从而导致2010年以前我国建立的防控措施效果大幅下降,致使该病在全国范围内再次呈爆发趋势。为了满足我国现阶段猪伪狂犬病病毒（PRV）抗原高频突变引发新疫情诊断的需求,本实验通过生物信息学分析比较,设计合成了多个针对PRV gB、gC、gG 3种糖蛋白高度保守的抗原优势表位区肽段,分别命名为gB872、gC144和gG237。分别以此三条肽段为抗原包被物,经过条件优化建立了PRV-gB间接ELISA抗体检测方法。该ELISA方法检测结果显示,仅对PRV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒（O型）、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无特异性反应,表明具有良好的特异性;与OIE推荐使用的荷兰BioC...
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PRV病毒体的结构
甘肃农业大学2019届硕士学位论文第一章绪论5图2.PRV基因组。（引自：T.C.Mettenleiter.PseudorabiesVirus[M].ElsevierInc.:2008-06-15.）图中显示了从完整基因组序列推导出的转录物和基因组织。PRV基因组的线性形式包括独特的长序列（UL），内部反向重复序列（IRS），独特的短序列（US）和末端反向重复序列（TRS）。显示了蛋白质编码区的预测位置，50和30个非翻译区，DNA重复，剪接位点和DNA复制的起源。
甘肃农业大学2019届硕士学位论文第三章间接ELISA方法的优化283.3实验结果3.3.1PRV-gB肽段间接ELISA检测方法临界值的确定使用上述完成优化的PRVgB间接ELISA方法，检测100份PRV阳、阴性的血清样品，计算阴性血清与阳性血清OD450nm差值（结果详见表3）。统计结果显示，标准阴性OD450nm平均值为0.385，标准阳性OD450nm平均值为1.006。根据公式S/P=（样本OD450nm值-OD450nm阴性对照平均值）/（阳性对照平均OD450nm值-OD450nm阴性对照平均值）以及阴阳性血清的检测结果，经计算确定S/P≥0.56为阳性，S/P＜0.56为阴性。3.3.2特异性实验应用本实验建立的ELISA方法进行特异性检测，同时与荷兰BioCheck公司以及深圳芬德生物公司的同类产品对PRRSV、PPV、PCV2、CSFV、FMDV(O)等5份阳性血清样品进行平行检测，表明该5份样品均为PRV阴性，与其它常见病毒的阳性血清均无交叉反应（图3），表明该ELISA方法特异性较强。BioCheck公司产品界定标准，S/P值>0.5为阳性判定，BioCheck抗体检测试剂盒的检测结果亦表明对上述5份样品均为伪狂犬病病毒阴性（图3），与本实验室建立的ELISA方法结果一致。然而，使用国内市售芬德AntibodyTestKit检测上述5份血清样品，以其界定的检测标准OD450nm值≥0.38为伪狂犬病病毒阳性，结果发现该抗体检测试剂盒检测上述五份单一阳性血清均呈现PRV阳性（图3），与本实验室建立的ELISA方法及BioCheck公司产品检测结果相差极大。图3.本实验建立的ELISA与国内外商品化抗体检测试剂盒比对分析Figure3.ComparativeanalysisbetweencommercializedELISAkitsandthekitdevelopedinthisstudy由此可知，本实验室建立的PRV-gB多肽间接ELISA检测方法特异性明显优于芬德抗体检测试剂盒所检测结果，与国外同类进口抗体检测试剂盒检测结果
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪伪狂犬病病毒gE蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 寇晓晶,高峰,郭慧琳,刘剑锋. 中国动物检疫. 2018(05)
[2]新流行猪伪狂犬病的临床发病规律和防控措施[J]. 陆春延,张有惠,李菊峰. 养猪. 2017(06)
[3]猪伪狂犬病的致病机制与防控措施[J]. 廖飞,黄增荣,赵孝木,莫心虎,吴通奎,姜艳,黄功明,杨先富. 贵州畜牧兽医. 2015(01)
[4]2014年猪病流行情况与2015年流行趋势及防控对策[J]. 杨汉春. 猪业科学. 2015(02)
[5]猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及其gE基因的分子特征[J]. 赵鸿远,彭金美,安同庆,李琳,冷超粮,陈家锃,王倩,常丹,张秋月,蔡雪辉,童光志,田志军. 中国预防兽医学报. 2014(07)
[6]伪狂犬病病毒Ra株体外感染ST细胞超微结构的研究[J]. 郭剑英,张晓战,黄红亮,许冬蕾,刘碧涛,任常宝,邵定勇,唐兆新. 中国畜牧兽医. 2013(11)
[7]我国猪伪狂犬病的最新流行动态与防控措施[J]. 全炎铭. 北方牧业. 2013(12)
[8]猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析[J]. 彭金美,安同庆,赵鸿远,刘益民,陈家锃,冷超粮,孙艳,常丹,田志军,童光志. 中国预防兽医学报. 2013(01)
[9]河南省猪伪狂犬病流行病学调查[J]. 王军,张秀凤,王瑞. 江苏农业科学. 2012(04)
[10]猪伪狂犬病病毒的分离鉴定[J]. 杨庆芳,宁官保,李俊达. 山西农业科学. 2011(08)
博士论文
[1]吉林省猪伪狂犬病流行病学调查与防控措施的研究及应用[D]. 初小辉.吉林大学 2011
[2]伪狂犬病毒上海株PK～-缺失株及PK～-gG～-双缺失株的构建及免疫原性初步研究[D]. 黄伟坚.南京农业大学 2006
硕士论文
[1]山东地区猪伪狂犬病的流行病学调查[D]. 范龙敏.山东农业大学 2017
[2]猪伪狂犬病的流行病学调查及防治[D]. 伏鹏.河南农业大学 2016
[3]山东省猪伪狂犬病流行病学调查及发病相关因素分析[D]. 王红岩.山东农业大学 2015
[4]山东省部分地区规模化猪场伪狂犬病流行病学调查[D]. 郑霞.山东农业大学 2014
[5]猪伪狂犬病病毒、猪乙型脑炎病毒LAMP检测方法的建立[D]. 王树芬.河南科技大学 2012
[6]猪伪狂犬病毒结构蛋白gB和gD主要抗原区的原核表达以及猪血清PRVgB抗体间接ELISA检测方法的建立[D]. 罗飞.扬州大学 2010
[7]南安市猪伪狂犬病流行病学调查及防控措施[D]. 张清燕.福建农林大学 2009
[8]我国部分规模化猪场伪狂犬病野毒感染状况调查及其净化方案的初步研究[D]. 贺纪云.河南农业大学 2009
[9]福建省猪伪狂犬病流行病学调查研究[D]. 吴顺意.扬州大学 2006
[10]伪狂犬病病毒gE糖蛋白主要抗原区的原核表达及gE抗体间接ELISA检测方法的初步建立[D]. 柴虹.扬州大学 2006
本文编号：3419134
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PRV病毒体的结构
甘肃农业大学2019届硕士学位论文第一章绪论5图2.PRV基因组。（引自：T.C.Mettenleiter.PseudorabiesVirus[M].ElsevierInc.:2008-06-15.）图中显示了从完整基因组序列推导出的转录物和基因组织。PRV基因组的线性形式包括独特的长序列（UL），内部反向重复序列（IRS），独特的短序列（US）和末端反向重复序列（TRS）。显示了蛋白质编码区的预测位置，50和30个非翻译区，DNA重复，剪接位点和DNA复制的起源。
甘肃农业大学2019届硕士学位论文第三章间接ELISA方法的优化283.3实验结果3.3.1PRV-gB肽段间接ELISA检测方法临界值的确定使用上述完成优化的PRVgB间接ELISA方法，检测100份PRV阳、阴性的血清样品，计算阴性血清与阳性血清OD450nm差值（结果详见表3）。统计结果显示，标准阴性OD450nm平均值为0.385，标准阳性OD450nm平均值为1.006。根据公式S/P=（样本OD450nm值-OD450nm阴性对照平均值）/（阳性对照平均OD450nm值-OD450nm阴性对照平均值）以及阴阳性血清的检测结果，经计算确定S/P≥0.56为阳性，S/P＜0.56为阴性。3.3.2特异性实验应用本实验建立的ELISA方法进行特异性检测，同时与荷兰BioCheck公司以及深圳芬德生物公司的同类产品对PRRSV、PPV、PCV2、CSFV、FMDV(O)等5份阳性血清样品进行平行检测，表明该5份样品均为PRV阴性，与其它常见病毒的阳性血清均无交叉反应（图3），表明该ELISA方法特异性较强。BioCheck公司产品界定标准，S/P值>0.5为阳性判定，BioCheck抗体检测试剂盒的检测结果亦表明对上述5份样品均为伪狂犬病病毒阴性（图3），与本实验室建立的ELISA方法结果一致。然而，使用国内市售芬德AntibodyTestKit检测上述5份血清样品，以其界定的检测标准OD450nm值≥0.38为伪狂犬病病毒阳性，结果发现该抗体检测试剂盒检测上述五份单一阳性血清均呈现PRV阳性（图3），与本实验室建立的ELISA方法及BioCheck公司产品检测结果相差极大。图3.本实验建立的ELISA与国内外商品化抗体检测试剂盒比对分析Figure3.ComparativeanalysisbetweencommercializedELISAkitsandthekitdevelopedinthisstudy由此可知，本实验室建立的PRV-gB多肽间接ELISA检测方法特异性明显优于芬德抗体检测试剂盒所检测结果，与国外同类进口抗体检测试剂盒检测结果
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪伪狂犬病病毒gE蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 寇晓晶,高峰,郭慧琳,刘剑锋. 中国动物检疫. 2018(05)
[2]新流行猪伪狂犬病的临床发病规律和防控措施[J]. 陆春延,张有惠,李菊峰. 养猪. 2017(06)
[3]猪伪狂犬病的致病机制与防控措施[J]. 廖飞,黄增荣,赵孝木,莫心虎,吴通奎,姜艳,黄功明,杨先富. 贵州畜牧兽医. 2015(01)
[4]2014年猪病流行情况与2015年流行趋势及防控对策[J]. 杨汉春. 猪业科学. 2015(02)
[5]猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及其gE基因的分子特征[J]. 赵鸿远,彭金美,安同庆,李琳,冷超粮,陈家锃,王倩,常丹,张秋月,蔡雪辉,童光志,田志军. 中国预防兽医学报. 2014(07)
[6]伪狂犬病病毒Ra株体外感染ST细胞超微结构的研究[J]. 郭剑英,张晓战,黄红亮,许冬蕾,刘碧涛,任常宝,邵定勇,唐兆新. 中国畜牧兽医. 2013(11)
[7]我国猪伪狂犬病的最新流行动态与防控措施[J]. 全炎铭. 北方牧业. 2013(12)
[8]猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析[J]. 彭金美,安同庆,赵鸿远,刘益民,陈家锃,冷超粮,孙艳,常丹,田志军,童光志. 中国预防兽医学报. 2013(01)
[9]河南省猪伪狂犬病流行病学调查[J]. 王军,张秀凤,王瑞. 江苏农业科学. 2012(04)
[10]猪伪狂犬病病毒的分离鉴定[J]. 杨庆芳,宁官保,李俊达. 山西农业科学. 2011(08)
博士论文
[1]吉林省猪伪狂犬病流行病学调查与防控措施的研究及应用[D]. 初小辉.吉林大学 2011
[2]伪狂犬病毒上海株PK～-缺失株及PK～-gG～-双缺失株的构建及免疫原性初步研究[D]. 黄伟坚.南京农业大学 2006
硕士论文
[1]山东地区猪伪狂犬病的流行病学调查[D]. 范龙敏.山东农业大学 2017
[2]猪伪狂犬病的流行病学调查及防治[D]. 伏鹏.河南农业大学 2016
[3]山东省猪伪狂犬病流行病学调查及发病相关因素分析[D]. 王红岩.山东农业大学 2015
[4]山东省部分地区规模化猪场伪狂犬病流行病学调查[D]. 郑霞.山东农业大学 2014
[5]猪伪狂犬病病毒、猪乙型脑炎病毒LAMP检测方法的建立[D]. 王树芬.河南科技大学 2012
[6]猪伪狂犬病毒结构蛋白gB和gD主要抗原区的原核表达以及猪血清PRVgB抗体间接ELISA检测方法的建立[D]. 罗飞.扬州大学 2010
[7]南安市猪伪狂犬病流行病学调查及防控措施[D]. 张清燕.福建农林大学 2009
[8]我国部分规模化猪场伪狂犬病野毒感染状况调查及其净化方案的初步研究[D]. 贺纪云.河南农业大学 2009
[9]福建省猪伪狂犬病流行病学调查研究[D]. 吴顺意.扬州大学 2006
[10]伪狂犬病病毒gE糖蛋白主要抗原区的原核表达及gE抗体间接ELISA检测方法的初步建立[D]. 柴虹.扬州大学 2006
本文编号：3419134
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