纳米材料G5-cRGD负载siRNA转染精原干细胞技术体系的建立
发布时间：2021-10-07 21:39
精原干细胞是精子发生的基础,位于睾丸曲细精管的基底膜,通过自我更新和分化源源不断地产生精子,以维持整个雄性生命过程中的生育能力。精原干细胞在遗传资源的保存、不孕不育和遗传疾病治疗等方面具有广阔的应用前景。但是脂质体或电转等方法转染精原干细胞的效率都低,限制了精原干细胞的研究与应用。聚酰胺-胺树状大分子（PAMAM）作为一种纳米材料,具有独特的三维结构,它的表面电荷和高密度的表面基团适合配体附着并具有促进靶向递送的作用。鉴于此,本研究以小鼠未分化A型精原细胞来源的C18-4细胞和原代精原干细胞作为研究对象,选择第五代PAMAM（G5）树状大分子,通过酰胺反应修饰cRGD多肽,合成PAMAM-cRGD（G5-cRGD）树状大分子,分析G5-cRGD树状大分子的物理化学特性、细胞毒性、内涵体逃逸能力和基因沉默效率,探究G5-cRGD是否能作为有效的基因递送载体负载siRNA转染精原干细胞,为精原干细胞后续的研究和临床应用奠定基础和提供有效的手段。主要研究结果如下:1、G5-cRGD能完全结合并负载siRNA。首先,通过红外光谱检测到G5-cRGD成功合成。其次,通过透射电镜观察到G5呈不规则...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 精原干细胞研究综述
1.1.1 精原干细胞简介
1.1.2 精原干细胞的分子标记
1.1.3 精原干细胞的增殖与分化调控
1.1.4 精原干细胞应用
1.2 RNA干扰技术
1.3 基因载体
1.4 聚酰胺-胺树状分子
1.4.1 聚酰胺-胺树状分子的性质及制备方法
1.4.2 聚酰胺-胺树状分子在基因递送上的应用前景
1.4.3 聚酰胺-胺树状分子在药物递送上的应用前景
1.5 本研究的目的和意义
第二章 G5-cRGD的合成及表征
2.1 材料和方法
2.1.1 材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 G5-cRGD材料的合成
2.1.4 傅里叶变换红外光谱(FTIR)
2.1.5 透射电镜观察纳米复合物的形态和粒径
2.1.6 凝胶阻滞试验
2.1.7 细胞培养与传代
2.1.8 CCK-8检测细胞毒性
2.2 结果
2.2.1 G5-cRGD的合成
2.2.2 G5-cRGD的表征
2.2.3 G5-cRGD的细胞毒性
2.3 讨论
2.4 小结
第三章 G5-cRGD在精原干细胞系的摄取和负载siRNA的能力
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 细胞系培养与传代
3.1.4 siRNA转染C18-4细胞系
3.1.5 流式细胞检测
3.1.6 摄取机制检测
3.1.7 溶酶体逃逸检测
3.1.8 RNA提取和反转录
3.1.9 定量PCR
3.1.10 Western Blot
3.1.11 CCK-8检测细胞增殖
3.1.12 EdU检测细胞增殖
3.2 结果
3.2.1 G5-cRGD的胞内定位
3.2.2 G5-cRGD递送siRNA的效率
3.2.3 G5-cRGD-siRNA复合物的摄取途径
3.2.4 G5-cRGD-siRNA复合物的内涵体逃逸能力
3.2.5 G5-cRGD负载Cdk1+Cdk2 siRNA沉默靶基因和抑制细胞增殖
3.3 讨论
3.4 小结
第四章 G5-cRGD在原代精原干细胞的摄取和负载siRNA的能力
4.1 材料与方法
4.1.1 材料
4.1.2 主要试剂
4.1.3 小鼠原代精原干细胞的分离与富集
4.1.4 猪原代精原干细胞的分离与富集
4.1.5 siRNA转染原代精原干细胞
4.1.6 细胞免疫荧光
4.1.7 RNA提取与定量PCR
4.1.8 雄性生殖干细胞来源的克隆数评定
4.1.9 EdU检测细胞增殖
4.1.10 数据统计分析
4.2 结果
4.2.1 G5-cRGD-siRNA复合物在小鼠原代精原干细胞的转染效率
4.2.2 G5-cRGD负载Cdk1+Cdk2 siRNA沉默靶基因和抑制细胞增殖
4.2.3 G5-cRGD-siRNA复合物在猪原代精原干细胞的转染效率
4.3 讨论
4.4 小结
结论与创新点
结论
创新点
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子的研究进展[J]. 崔玉花,尹少宏,崔玉,孙国新. 济南大学学报(自然科学版). 2007(04)
本文编号：3422821
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 精原干细胞研究综述
1.1.1 精原干细胞简介
1.1.2 精原干细胞的分子标记
1.1.3 精原干细胞的增殖与分化调控
1.1.4 精原干细胞应用
1.2 RNA干扰技术
1.3 基因载体
1.4 聚酰胺-胺树状分子
1.4.1 聚酰胺-胺树状分子的性质及制备方法
1.4.2 聚酰胺-胺树状分子在基因递送上的应用前景
1.4.3 聚酰胺-胺树状分子在药物递送上的应用前景
1.5 本研究的目的和意义
第二章 G5-cRGD的合成及表征
2.1 材料和方法
2.1.1 材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 G5-cRGD材料的合成
2.1.4 傅里叶变换红外光谱(FTIR)
2.1.5 透射电镜观察纳米复合物的形态和粒径
2.1.6 凝胶阻滞试验
2.1.7 细胞培养与传代
2.1.8 CCK-8检测细胞毒性
2.2 结果
2.2.1 G5-cRGD的合成
2.2.2 G5-cRGD的表征
2.2.3 G5-cRGD的细胞毒性
2.3 讨论
2.4 小结
第三章 G5-cRGD在精原干细胞系的摄取和负载siRNA的能力
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 细胞系培养与传代
3.1.4 siRNA转染C18-4细胞系
3.1.5 流式细胞检测
3.1.6 摄取机制检测
3.1.7 溶酶体逃逸检测
3.1.8 RNA提取和反转录
3.1.9 定量PCR
3.1.10 Western Blot
3.1.11 CCK-8检测细胞增殖
3.1.12 EdU检测细胞增殖
3.2 结果
3.2.1 G5-cRGD的胞内定位
3.2.2 G5-cRGD递送siRNA的效率
3.2.3 G5-cRGD-siRNA复合物的摄取途径
3.2.4 G5-cRGD-siRNA复合物的内涵体逃逸能力
3.2.5 G5-cRGD负载Cdk1+Cdk2 siRNA沉默靶基因和抑制细胞增殖
3.3 讨论
3.4 小结
第四章 G5-cRGD在原代精原干细胞的摄取和负载siRNA的能力
4.1 材料与方法
4.1.1 材料
4.1.2 主要试剂
4.1.3 小鼠原代精原干细胞的分离与富集
4.1.4 猪原代精原干细胞的分离与富集
4.1.5 siRNA转染原代精原干细胞
4.1.6 细胞免疫荧光
4.1.7 RNA提取与定量PCR
4.1.8 雄性生殖干细胞来源的克隆数评定
4.1.9 EdU检测细胞增殖
4.1.10 数据统计分析
4.2 结果
4.2.1 G5-cRGD-siRNA复合物在小鼠原代精原干细胞的转染效率
4.2.2 G5-cRGD负载Cdk1+Cdk2 siRNA沉默靶基因和抑制细胞增殖
4.2.3 G5-cRGD-siRNA复合物在猪原代精原干细胞的转染效率
4.3 讨论
4.4 小结
结论与创新点
结论
创新点
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子的研究进展[J]. 崔玉花,尹少宏,崔玉,孙国新. 济南大学学报(自然科学版). 2007(04)
本文编号：3422821
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