猪骨骼肌特异性表达基因myoz1/tnnc2启动子的克隆及功能验证

发布时间：2021-10-08 23:25

　　启动子是一段能起始下游基因转录的DNA调控序列,选择合适的启动子可以驱使目的基因在特定的组织表达,如消化道特异性启动子驱动植酸酶基因在消化道内表达或骨骼肌特异性启动子驱动脂肪相关基因在肌肉中表达。PPARy （Peroxisome Proliferator-Activated Receptors y）基因作为研究肌内脂肪含量的候选主效基因,能调控脂肪细胞的分化及脂肪沉积。因此,设想通过肌肉组织特异性启动子提高PPARy在肌肉中的表达,增加肌肉中脂肪的沉积,以提高肌内脂肪的含量。本研究通过克隆,筛选及功能验证肌肉组织特异性表达基因myozl （Myozenin1）和tnnc2（Fast Skeletal Muscle Troponin C）的启动子区域,获得具有肌肉组织特异性调控功能的核心启动子,再利用核心启动子成功调控外源基因PPARy在成肌细胞中表达,为构建转基因小鼠模型提供一定的理论基础。取得结果如下：（1）根据进化印记法理论,采用软件MEME分析myozl及tnnc2的调控区域,发现myozl调控区域的保守序列集中在第一外显子5’端附近,而tnnc2调控区域的保守序列集中在第一外... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
    1 启动子概述
        1.1 启动子的分类
        1.2 核心启动子调控元件的结构
        1.3 其它重要调控元件的结构
    2 启动子的研究方法
        2.1 基于常规试验的研究方法
            2.1.1 启动子序列的克隆方法
            2.1.2 启动子功能的分析方法
        2.2 基于生物信息学理论的启动子分析方法
    3 myoz1及tnnc2启动子研究现状
        3.1 myoz1启动子研究现状
        3.2 tnnc2启动子的研究现状
    4 PPARγ的概述
    5 研究目的及意义
第二章 材料与方法
    1 试验材料
        1.1 DNA样品
        1.2 载体和菌株
        1.3 试剂及其配置
            1.3.1 主要试剂
            1.3.2 试剂的配置
        1.4 主要数据库及分析软件
    2 试验方法
        2.1 猪myoz1和tnnc2基因启动子的克隆及重组表达质粒的构建
            2.1.1 猪myoz1和tnnc2调控序列的获得
            2.1.2 转录因子结合位点的分析及缺失片段设计
            2.1.3 PCR扩增产物的检测和回收
            2.1.4 PCR产物及pGL3-basic载体双酶切及回收
            2.1.5 pGL3-basic缺失重组表达质粒的构建
        2.2 细胞培养及诱导分化
            2.2.1 细胞的复苏
            2.2.2 细胞的常规培养
            2.2.3 细胞冻存
            2.2.4 C2C12细胞的诱导分化
        2.3 细胞转染及双荧光素酶活性的测定
            2.3.1 细胞的转染
            2.3.2 双荧光素酶相对活性的检测
            2.3.3 数据的处理及分析
        2.4 pEGFP-N1重组表达质粒的构建
        2.5 增强型绿色荧光蛋白表达的观测
        2.6 核心启动子与PPARγ基因的重组构建
            2.6.1 猪PPARγ基因CDS区域的克隆
            2.6.2 猪PPARγ重组质粒的鉴定
        2.7 C2C12细胞的PPARγ表达量测定
            2.7.1 C2C12细胞RNA的提取及反转录
            2.7.2 定量PCR分析PPARγ在C2C12细胞中的表达量
            2.7.3 C2C12细胞蛋白质的提取
            2.7.4 Western blot检测PPARγ蛋白的表达
        2.8 PPARγ重组表达质粒的线性化
第三章 结果与分析
    1 猪myoz1和tnnc2启动子功能分析及验证
        1.1 猪myoz1和tnnc2启动子的生物信息学分析
            1.1.1 MEME分析猪myoz1和tnnc2调控区域
            1.1.2 调控区域转录因子结合位点的预测
        1.2 猪myoz1和tnnc2启动子的克隆及缺失重组质粒的构建
        1.3 C2C12细胞的诱导分化
        1.4 猪myoz1和tnnc2启动子及缺失重组质粒的双荧光素酶活性检测
        1.5 pEGFP-N1重组质粒的构建及绿色荧光蛋白的检测
    2 猪PPARγ表达载体的构建及表达量的测定
        2.1 猪PPARγ表达载体的构建
        2.2 定量PCR检测C2C12细胞中PPARγ的表达量
        2.3 western blot检测PPARγ蛋白的表达
第四章 讨论
    1 进化印记法分析启动子
    2 猪myoz1及tnnc2启动子在小鼠C2C12、分化后的C2C12、3T3-L1细胞中的活性分析
    3 tnnc2启动子可能存在的一段增强子序列
    4 MEF-2、MyoD影响myoz1及tnnc2的启动子活性
    5 增强启动子活性以提高外源PPARγ的表达
第五章 小结
    1 本研究取得的成果
    2 下一步工作计划
参考文献
附录一：猪myoz1基因核心启动子序列
附录二：猪tnnc2基因核心启动子序列
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]牛Sry启动子调控序列的鉴定[J]. 韩凤桐,林秀坤,刘娣,吴宁,廖冰.  中国农业科学. 2010(14)
[2]拟南芥盐胁迫响应启动子的生物信息学分析[J]. 吴炳江,阎鹏磊,刘东篱,郑成超,杨国栋.  山东农业大学学报(自然科学版). 2010(02)
[3]启动子序列克隆和功能分析方法的研究进展[J]. 杨晓娜,赵昶灵,李云,李会容,苏丽,周燕琼.  云南农业大学学报(自然科学版). 2010(02)
[4]人类基因组中的保守非编码元件[J]. 田靖,赵志虎,陈惠鹏.  遗传. 2009(11)
[5]中国李pgip启动子的克隆及调控元件分析[J]. 李广平,张长青,章镇,曹福亮.  园艺学报. 2009(10)
[6]猪Calsarcin-2基因编码区的克隆及组织表达谱分析[J]. 苏玉虹,刘东鑫,宋慧娟,曾瑞霞,巴彩凤,王洪才.  辽宁医学院学报. 2008(05)
[7]VEGFR3基因启动子中的功能区段预测[J]. 焦吉祥,张长青,王进.  药物生物技术. 2008(04)
[8]猪骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因的cDNA克隆与表达分析[J]. 田兴国,陈瑶生,凌飞,梅盈洁,王翀,罗永发,李加琪.  遗传. 2006(08)
[9]增强子作用机制的研究进展[J]. 贾春平,曾溢滔.  生命科学. 2002(02)

博士论文
[1]日粮能量水平对猪肌内脂肪沉积的影响及作用机制研究[D]. 刘作华.四川农业大学 2008
[2]肌肉中calsarcin基因的差异表达和转录调控研究[D]. 王恒.华中农业大学 2007



本文编号：3425175