布鲁氏菌rOmp31 48-74 -BLS重组载体的构建与苜蓿的转化
发布时间：2021-10-09 23:51
将布鲁氏菌rOmp3148-74-BLS基因转入紫花苜蓿中苜一号,最终获得转基因苜蓿。本试验利用不依赖于连接反应的克隆（Ligation-Independent Cloning,LIC）方法将布鲁氏菌rOmp3148-74-BLS基因克隆到植物表达载体pJG045上,并利用三亲本杂交的方法转化农杆菌AGL0。最后通过农杆菌介导法将该基因转化紫花苜蓿中苜一号。经PCR鉴定,筛选出转基因苜蓿植株。本试验为今后布鲁氏菌转基因植物疫苗的研发奠定了理论和实验基础。
【文章来源】：植物研究. 2014,34(04)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
菌落PCＲ鉴定M．DNAMarker;1～7．菌落PCＲFig．3PCＲofcolonyM．DNAMarker;1－7．ColonyPCＲ
銹CＲ鉴定，如图3～4所示，其中两个菌落可以扩增出500～600bp的条带，与rOmp3148－74-BLS基因长度相符，说明这两个菌落为阳性克拢提取该菌质粒，进行EcoＲⅠ和PstⅠ双酶切鉴定，大片段位于8000～10000bp，小片段位于1000～2000bp;长度与预期相符。说明rOmp3148－74-BLS基因已经成功克隆到载体pJG045。重组质粒送至山东农业科学院进行测序鉴定，测序结果与该基因的序列完全一致，证明重组载体pJG-OB构建成功。图3菌落PCＲ鉴定M．DNAMarker;1～7．菌落PCＲFig．3PCＲofcolonyM．DNAMarker;1－7．ColonyPCＲ图4重组质粒的EcoＲⅠ和PstⅠ双酶切鉴定M．DNAMarker;1～4．重组质粒的EcoＲⅠ和PstⅠ双酶切鉴定Fig．4DigestionwithEcoＲⅠandPstⅠM．DNAMarker;1－4．DigestionwithEcoＲⅠandPstⅠ2．3农杆菌的转化与鉴定利用三亲本杂交法对转化农杆菌AGL0，长出的菌落进行菌落PCＲ鉴定。如图5所示，经电泳检测，扩增出的片段与rOmp3148－74-BLS基因长度相符，说明携带rOmp3148－74-BLS基因的质粒已经成功转入农杆菌AGL0。5074期赵亮等:布鲁氏菌rOmp3148－74-BLS重组载体的构建与苜蓿的转化
图5农杆菌菌落PCＲ鉴定M．DNAMarker:1～8．农杆菌菌落PCＲ鉴定Fig．5PCＲofAgrobacteriumcolonyM．DNAMarker;1－8．AgrobacteriumcolonyPCＲ图6抗潮霉素愈伤组织筛选Fig．6Hygromycin-resistantcallusfilter图7再生苗与抗性愈伤组织的PCＲ鉴定M．DNAMarker;1．转基因苜蓿再生苗叶片;2．未转基因的苜蓿叶片(阴性对照);3～6．抗性愈伤组织;7．重组质粒PCＲ(阳性对照)Fig．7PCＲofresistantcallusandregeneratedplantsM．DNAMarker;1．Transgenicleavesofregenerationseedling;2．Untransformedalfalfaleaves(negativecontrol);3－6．Ｒesistantcal-lus;7．Ｒecombinant(positivecontrol)2．4苜蓿的遗传转化与鉴定载体pJG045上带有潮霉素抗性标记基因，如图6所示，将经过共培养的外植体接种到筛选培养基上进行潮霉素筛选培养，转化后的愈伤组织因具有潮霉素抗性，所以生长良好。而图中箭头标记的未转化的愈伤组织则褐化死亡。经组织培养，将最终获得的苜蓿再生苗与抗性愈伤组织进行基因组DNAPCＲ鉴定;如图7所示，扩增产生的片段位于500～750bp，与rOmp3148－74-BLS基因长度相符。最终将其移栽至培养土中，获得一株苜蓿转基因再生植株(图8)。图8苜蓿转基因再生苗Fig．8Transgenicalfalfaseedlings3讨论3．1LIC克隆重组效率的提高LIC克隆方法简便易行，比之于传统的克隆方法，LIC更适合高通量基因克隆和蛋白质表达［10］。本研究发现LIC克隆方法尚存在假阳性率高的问题。针对这一问题，本试验通过控制载体与目的片段摩尔比的方法，有效地减少了假阳性问题的发生，最佳摩尔比为目的片段∶载体=5∶1。其次，经T4DNA聚合酶处理后的单链DNA末端易形成不稳定的二级结构，通过控制退火程序降温速度的方法，适当减慢反?
本文编号：3427228
【文章来源】：植物研究. 2014,34(04)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
菌落PCＲ鉴定M．DNAMarker;1～7．菌落PCＲFig．3PCＲofcolonyM．DNAMarker;1－7．ColonyPCＲ
銹CＲ鉴定，如图3～4所示，其中两个菌落可以扩增出500～600bp的条带，与rOmp3148－74-BLS基因长度相符，说明这两个菌落为阳性克拢提取该菌质粒，进行EcoＲⅠ和PstⅠ双酶切鉴定，大片段位于8000～10000bp，小片段位于1000～2000bp;长度与预期相符。说明rOmp3148－74-BLS基因已经成功克隆到载体pJG045。重组质粒送至山东农业科学院进行测序鉴定，测序结果与该基因的序列完全一致，证明重组载体pJG-OB构建成功。图3菌落PCＲ鉴定M．DNAMarker;1～7．菌落PCＲFig．3PCＲofcolonyM．DNAMarker;1－7．ColonyPCＲ图4重组质粒的EcoＲⅠ和PstⅠ双酶切鉴定M．DNAMarker;1～4．重组质粒的EcoＲⅠ和PstⅠ双酶切鉴定Fig．4DigestionwithEcoＲⅠandPstⅠM．DNAMarker;1－4．DigestionwithEcoＲⅠandPstⅠ2．3农杆菌的转化与鉴定利用三亲本杂交法对转化农杆菌AGL0，长出的菌落进行菌落PCＲ鉴定。如图5所示，经电泳检测，扩增出的片段与rOmp3148－74-BLS基因长度相符，说明携带rOmp3148－74-BLS基因的质粒已经成功转入农杆菌AGL0。5074期赵亮等:布鲁氏菌rOmp3148－74-BLS重组载体的构建与苜蓿的转化
图5农杆菌菌落PCＲ鉴定M．DNAMarker:1～8．农杆菌菌落PCＲ鉴定Fig．5PCＲofAgrobacteriumcolonyM．DNAMarker;1－8．AgrobacteriumcolonyPCＲ图6抗潮霉素愈伤组织筛选Fig．6Hygromycin-resistantcallusfilter图7再生苗与抗性愈伤组织的PCＲ鉴定M．DNAMarker;1．转基因苜蓿再生苗叶片;2．未转基因的苜蓿叶片(阴性对照);3～6．抗性愈伤组织;7．重组质粒PCＲ(阳性对照)Fig．7PCＲofresistantcallusandregeneratedplantsM．DNAMarker;1．Transgenicleavesofregenerationseedling;2．Untransformedalfalfaleaves(negativecontrol);3－6．Ｒesistantcal-lus;7．Ｒecombinant(positivecontrol)2．4苜蓿的遗传转化与鉴定载体pJG045上带有潮霉素抗性标记基因，如图6所示，将经过共培养的外植体接种到筛选培养基上进行潮霉素筛选培养，转化后的愈伤组织因具有潮霉素抗性，所以生长良好。而图中箭头标记的未转化的愈伤组织则褐化死亡。经组织培养，将最终获得的苜蓿再生苗与抗性愈伤组织进行基因组DNAPCＲ鉴定;如图7所示，扩增产生的片段位于500～750bp，与rOmp3148－74-BLS基因长度相符。最终将其移栽至培养土中，获得一株苜蓿转基因再生植株(图8)。图8苜蓿转基因再生苗Fig．8Transgenicalfalfaseedlings3讨论3．1LIC克隆重组效率的提高LIC克隆方法简便易行，比之于传统的克隆方法，LIC更适合高通量基因克隆和蛋白质表达［10］。本研究发现LIC克隆方法尚存在假阳性率高的问题。针对这一问题，本试验通过控制载体与目的片段摩尔比的方法，有效地减少了假阳性问题的发生，最佳摩尔比为目的片段∶载体=5∶1。其次，经T4DNA聚合酶处理后的单链DNA末端易形成不稳定的二级结构，通过控制退火程序降温速度的方法，适当减慢反?
本文编号：3427228
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