猪传染性胃肠炎病毒M蛋白诱导IFN-β表达分子机制及功能域研究
发布时间：2021-10-11 03:19
猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,可引起猪急性、高度接触性、传染性肠道疾病——猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）。自2010年以来,TGE在我国多个省市的暴发,给养猪业造成了巨大的经济损失,制约了我国规模化猪场的健康高速发展。TGEV致病机制的研究有助于对TGE的防控。有研究报道TGEV感染可以诱导I型干扰素（IFN）的产生。IFN及其下游的干扰素刺激因子（ISGs）能够有效的抑制病毒感染和病毒在体内的增殖,是宿主抗病毒感染的重要环节。多数病毒感染是拮抗IFN产生的,而TGEV感染细胞后可以诱导I型IFN的产生,目前对其具体分子机制的相关研究报道较少。本研究使用TGEV HE-1株在IPEC-J2细胞上传代适应,盲传至第八代时,细胞开始出现典型的细胞病变（cytopathic effect,CPE）,经RT-PCR验证TGEV HE-1株可以在IPEC-J2细胞上适应,荧光显微镜下可观察到随着感染病毒滴度的增加,绿色荧光信号逐渐增强。T...
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 前言
1.1 猪传染性胃肠炎概述
1.2 TGEV病原学
1.2.1 TGEV生物学分类及形态学特征
1.2.2 TGEV理化性质及体外培养特性
1.3 TGEV分子生物学特征
1.3.1 TGEV基因组结构
1.3.2 TGEV结构蛋白及生物学功能
1.4 猪小肠黏膜上皮细胞(IPEC-J2)
1.5 天然免疫概述
1.5.1 天然免疫简介
1.5.2 I型IFN概述
1.5.3 IFN-β转录激活机制
1.5.4 干扰素调节因子IRF-
1.6 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 细胞、病毒、菌种和质粒
2.1.2 主要试剂、工具酶和抗体
2.1.3 实验试剂的配制
2.1.4 实验仪器
2.1.5 引物设计
2.1.6 siRNA的合成
2.2 实验方法
2.2.1 TGEV感染IPEC-J2细胞及RT-PCR检测
2.2.2 Real-time RT-PCR检测TGEV在IPEC-J2细胞上盲传病毒的增殖
2.2.3 TGEV在IPEC-J2细胞上的病毒滴度和生长曲线测定
2.2.4 TGEV间接免疫荧光(IFA)检测
2.2.5 TGEV结构蛋白真核重组质粒的构建和鉴定
2.2.6 TGEV重组质粒和siRNA的转染
2.2.7 IPEC-J2细胞的细胞核和细胞质蛋白提取
2.2.8 Western blot检测蛋白表达情况
2.2.9 双荧光素酶检测启动子活性
2.2.10 激光共聚焦显微镜观察
2.2.11 数据统计
3 结果
3.1 TGEV感染IPEC-J2细胞
3.1.1 TGEV在IPEC-J2细胞上增殖的RT-PCR检测
3.1.2 TGEV在IPEC-J2细胞上增殖的Real-time RT-PCR检测方法建立
3.1.3 TGEV在IPEC-J2细胞上的病毒滴度和生长曲线
3.1.4 TGEV感染IPEC-J2细胞的IFA检测
3.2 TGEV感染IPEC-J2细胞诱导IFN-β产生的分子机制研究
3.2.1 TGEV感染激活IFN-β的转录
3.2.2 TGEV感染依赖于IRF-3激活IFN-β信号通路
3.2.3 TGEV感染对IRF-3的影响
3.3 TGEV M蛋白激活IFN-β产生
3.3.1 TGEV各结构蛋白基因真核表达质粒的构建
3.3.2 TGEV各结构蛋白基因真核表达质粒的鉴定
3.3.3 TGEV激活IFN-β表达的结构蛋白确定
3.3.4 TGEV M蛋白激活IFN-β表达的分子机制
3.4 TGEV M蛋白激活IFN-β表达功能域的确定
3.4.1 TGEV M蛋白截短基因的真核表达质粒构建和鉴定
3.4.2 TGEV M蛋白激活IFN-β表达功能域的确定
4 讨论
4.1 TGEV HE-1 株在IPEC-J2细胞上传代适应
4.2 提高TGEV各蛋白在IPEC-J2细胞中表达方法的优化
4.3 TGEV感染IPEC-J2细胞诱导IFN-β表达上调的分子机制
4.4 TGEV M蛋白激活IFN-β表达的功能域确定
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
本文编号：3429685
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 前言
1.1 猪传染性胃肠炎概述
1.2 TGEV病原学
1.2.1 TGEV生物学分类及形态学特征
1.2.2 TGEV理化性质及体外培养特性
1.3 TGEV分子生物学特征
1.3.1 TGEV基因组结构
1.3.2 TGEV结构蛋白及生物学功能
1.4 猪小肠黏膜上皮细胞(IPEC-J2)
1.5 天然免疫概述
1.5.1 天然免疫简介
1.5.2 I型IFN概述
1.5.3 IFN-β转录激活机制
1.5.4 干扰素调节因子IRF-
1.6 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 细胞、病毒、菌种和质粒
2.1.2 主要试剂、工具酶和抗体
2.1.3 实验试剂的配制
2.1.4 实验仪器
2.1.5 引物设计
2.1.6 siRNA的合成
2.2 实验方法
2.2.1 TGEV感染IPEC-J2细胞及RT-PCR检测
2.2.2 Real-time RT-PCR检测TGEV在IPEC-J2细胞上盲传病毒的增殖
2.2.3 TGEV在IPEC-J2细胞上的病毒滴度和生长曲线测定
2.2.4 TGEV间接免疫荧光(IFA)检测
2.2.5 TGEV结构蛋白真核重组质粒的构建和鉴定
2.2.6 TGEV重组质粒和siRNA的转染
2.2.7 IPEC-J2细胞的细胞核和细胞质蛋白提取
2.2.8 Western blot检测蛋白表达情况
2.2.9 双荧光素酶检测启动子活性
2.2.10 激光共聚焦显微镜观察
2.2.11 数据统计
3 结果
3.1 TGEV感染IPEC-J2细胞
3.1.1 TGEV在IPEC-J2细胞上增殖的RT-PCR检测
3.1.2 TGEV在IPEC-J2细胞上增殖的Real-time RT-PCR检测方法建立
3.1.3 TGEV在IPEC-J2细胞上的病毒滴度和生长曲线
3.1.4 TGEV感染IPEC-J2细胞的IFA检测
3.2 TGEV感染IPEC-J2细胞诱导IFN-β产生的分子机制研究
3.2.1 TGEV感染激活IFN-β的转录
3.2.2 TGEV感染依赖于IRF-3激活IFN-β信号通路
3.2.3 TGEV感染对IRF-3的影响
3.3 TGEV M蛋白激活IFN-β产生
3.3.1 TGEV各结构蛋白基因真核表达质粒的构建
3.3.2 TGEV各结构蛋白基因真核表达质粒的鉴定
3.3.3 TGEV激活IFN-β表达的结构蛋白确定
3.3.4 TGEV M蛋白激活IFN-β表达的分子机制
3.4 TGEV M蛋白激活IFN-β表达功能域的确定
3.4.1 TGEV M蛋白截短基因的真核表达质粒构建和鉴定
3.4.2 TGEV M蛋白激活IFN-β表达功能域的确定
4 讨论
4.1 TGEV HE-1 株在IPEC-J2细胞上传代适应
4.2 提高TGEV各蛋白在IPEC-J2细胞中表达方法的优化
4.3 TGEV感染IPEC-J2细胞诱导IFN-β表达上调的分子机制
4.4 TGEV M蛋白激活IFN-β表达的功能域确定
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
本文编号：3429685
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3429685.html
