抗牛PD-1抗体制备及PD-1多抗阻断对BVDV感染PBL细胞增殖和凋亡的影响

发布时间：2021-10-12 01:54

　　牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）可感染世界范围内的反刍动物,每年可造成约20亿美元的经济损失。BVDV主要在淋巴细胞群中复制,导致动物体内白细胞的数量严重减少,引起免疫抑制,并且淋巴细胞衰竭程度与BVDV毒株的毒力有关,具有可逆性。已知程序性细胞死亡蛋白-1（Programmed cell death protein-1,PD-1）参与机体外周免疫耐受和抗原特异性免疫抑制,导致T细胞耗尽。PD-1在慢性病毒感染的T细胞上高度表达,并且阻断PD-1与PD-L1的结合,能够恢复T细胞功能。然而在BVDV急性感染期间,阻断PD-1/PD-L1途径是否可以恢复淋巴细胞的水平尚不明确。本研究通过克隆表达牛PD-1胞外区蛋白,制备多抗和单克隆抗体,确定抗体阻断对BVDV感染PBL细胞增殖和凋亡的影响。首先,本研究通过PCR技术克隆牛PD-1胞外区基因,插入pET-28a原核表达载体,构建重组质粒pET-28a-PD-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,SDS-PAGE和Western-blot检测IPTG诱导的蛋白表达情况。结果表明,序... 

【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省

【文章页数】：83 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

牛PD-1胞外区PCR鉴定

使用 PD-1 胞外区引物 PCR 鉴定及双酶切鉴定（图2-2A 和图 2-2B），鉴定正确后送公司测序，将测序结果与 GenBank 中公布的牛 PD-1 序列进行比对，同源性 100%。2.3.3 牛 PD-1 胞外区的生物信息学分析2.3.3.1 牛 PD-1 胞外区的序列分析通过 MEGE6 和 Lasergene 进行同源性比较（图 2-3A，图 2-3 B），可以发现构建 PD-1胞外区质粒与奶牛和瘤牛 PD-1 胞外区序列同源性达到 100%，与牦牛、野生牦牛和水牛的同源性为 99.3%、98.9%和 97.7%，与绵羊和山羊的同源性为 93.6%和 91.5%。与人和鼠的序列相比同源性分别为 79%和 71%。448bp448bp图 2-2：pMD18-T-PD-1 菌液 PCR 鉴定和双酶切鉴定Fig.2-2: PCR and double enzyme digestion identification of pMD18-T-PD-1 bacterial solution图 A M：DL2000 标准； 1-3：菌液 PCR 模板Fig.A M: DL 2000 Marker, 1-3: Bacterial fluid PCR图 B M：DL2000 标准；1-3：pMD18-T-PD-1 重组质粒Fig.B M: DL 2000 Marker

图 2-3：牛 PD-1 胞外区序列分Fig.2-3: Sequence analysis of the extracellular dom图 A：PD-1 胞外区蛋白的同源性分图 B：PD-1 胞外区蛋白的进化树分


本文编号：3431661