CD163 N端与MYH9 C端蛋白互作在促进PRRSV入侵易感细胞过程中的机制研究
发布时间：2021-10-12 12:58
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是导致猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的致病病原,PRRSV对易感细胞有着严格的细胞趋向性,该病毒主要感染单核-巨噬细胞系,包括其天然易感宿主细胞--猪肺泡巨噬细胞（PAMs）。PRRSV入侵易感细胞系需要多种因子的介导,包括CD163,非肌肉肌球蛋白重链9（MYH9）,唾液酸黏附素（Sn）,硫酸乙酰肝素（HS）,Vimentin,CD151,CD209等。前人以及本实验室的研究结果显示,CD163和MYH9是PRRSV入侵易感细胞的两个不可或缺的受体或辅助受体蛋白,但是这两个蛋白在病毒感染过程中是否存在相互作用还未可知。因此,本研究对CD163与MYH9的相互作用及其在PRRSV入侵易感细胞系中的作用机制展开了一系列的探讨。主要得到以下结果:1.通过免疫共沉淀实验,我们发现CD163和MYH9在PRRSV天然宿主细胞PAMs中存在相互作用现象,并且该互作并不依赖于病毒的感染状态。2.在HEK293T细胞中,我们将构建的CD163和MYH9截短表达质粒共转染,免疫共沉淀实验结果表明CD163氨基端4个串联重复的SRCR结构域SRCR1-4与MYH9羧基...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：107 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展
1.1 PRRSV起源
1.2 PRRSV临床症状
1.3 PRRSV病理变化
1.4 PRRSV基因组组成
1.5 PRRSV非结构蛋白
1.6 PRRSV结构蛋白
1.7 PRRSV疫苗防控
第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒受体研究进展
2.1 CD163
2.2 非肌肉肌球蛋白重链 9(MYH9)
2.3 唾液酸黏附素(Sn)
2.4 其他受体分子
2.5 本研究的目的与意义
第三章 CD163与MYH9互作区域鉴定
3.1 实验材料
3.1.1 细胞,质粒和病毒
3.1.2 实验试剂与主要耗材
3.1.3 主要实验仪器设备
3.1.4 主要缓冲液配制
3.2 实验方法
3.2.1 免疫共沉淀实验验证PAMs内CD163与MYH9的互作
3.2.2 PAMs膜蛋白提取
3.2.3 免疫共沉淀实验验证CD163与MYH9的互作区域
3.2.4 Western Blot检测蛋白表达
3.2.5 原核表达系统表达纯化蛋白
3.2.6 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测SRCR1-4 与PRA蛋白的直接互作
3.2.7 Far-Western Blot检测SRCR1-4 与PRA的直接互作
3.2.8 Confocal验证重组表达的SRCR1-4 与PAMs细胞膜上MYH9的共定位
3.2.9 免疫共沉淀验证重组表达的SRCR1-4 与PAMs细胞膜上MYH9的互作
3.3 实验结果
3.3.1 CD163与MYH9在PAMs中相互作用
3.3.2 CD163蛋白的N端结构域SRCR1-4 与MYH9蛋白的C端区域PRA相互作用
3.3.3 SRCR1-4 蛋白表达与纯化
3.3.4 SRCR1-4 与PRA直接相互作用
3.3.5 SRCR1-4 蛋白与PAMs膜上分布的MYH9相互作用
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 SRCR1-4 与PRA的互作对PRRSV感染的影响
4.1 实验材料
4.1.1 细胞,质粒和病毒
4.1.2 实验试剂和主要耗材
4.1.3 主要实验仪器设备
4.2 实验方法
4.2.1 稳定表达CD163及其截短片段的HEK293T细胞系构建
4.2.2 免疫共沉淀检测HEK293T细胞系中CD163与MYH9的互作
4.2.3 PRRSV在HEK293T稳筛细胞系中吸附,内化,解离,复制过程的分析
4.2.4 PRRSV在HEK293TCD163,HEK293TSRCR1-4,HEK293TSRCR5-CT细胞系中的复制差异分析
4.3 实验结果
4.3.1 HEK293T~(CD163),HEK293T~(SRCR1-4),HEK293T~(SRCR5-CT)细胞系的建立与鉴定
4.3.2 HEK293T~(CD163),HEK293T~(SRCR1-4),HEK293T~(SRCR5-CT)细胞系中CD163与MYH9的互作
4.3.3 SRCR1-4 对于PRRSV在易感细胞内的入侵发挥重要作用
4.3.4 SRCR1-4 的表达影响PRRSV的复制效率
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 重组表达SRCR1-4 蛋白对PRRSV感染的抑制作用
5.1 实验材料
5.1.1 细胞,病毒和蛋白
5.1.2 实验试剂和主要耗材
5.1.3 主要仪器设备
5.2 实验方法
5.2.1 原核表达的SRCR1-4 蛋白对PRRSV在PAMs中内化的影响
5.2.2 不同浓度的SRCR1-4 蛋白孵育PAMs后对II型PRRSV的抑制作用
5.2.3 SRCR1-4 蛋白对细胞的毒性检测
5.2.4 重组SRCR1-4 蛋白对I,II型PRRSV的广谱性抑制作用
5.3 实验结果
5.3.1 重组SRCR1-4 蛋白抑制PRRSV在PAMs中的内化过程
5.3.2 重组SRCR1-4 蛋白对PRRSV具有广谱性抑制作用
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 CD163与MYH9互作区域的表达与纯化
6.1 实验材料
6.1.1 细胞与质粒
6.1.2 主要试剂耗材
6.1.3 主要实验仪器设备
6.3 实验方法
6.3.1 Far-Western Blot鉴定SRCR1-4 蛋白与截短PRA片段之间的互作
6.3.2 His-pull down检测SRCR1-4 与截短PRA蛋白之间的相互作用
6.3.3 SRCR1-4 与PRA互作区域的表达纯化
6.3.4 真核表达的PRA100与原核表达的SRCR1-4 蛋白之间的互作检测
6.3.5 稳定分泌表达 CD163 胞外区蛋白（SRCR1-PSTII）的 293s 悬浮细胞系构建
6.3.6 SRCR1-PSTII蛋白的纯化
6.3.7 SRCR1-PSTII蛋白透射电镜观察
6.4 实验结果
6.4.1 CD163 SRCR1-4 蛋白与PRA截短片段之间的互作
6.4.2 PRA100蛋白的表达纯化
6.4.3 真核表达的PRA100与原核表达SRCR1-4 蛋白之间的互作
6.4.4 CD163胞外区结构域SRCR1-PSTII蛋白的表达与纯化
6.4.5 SRCR1-PSTII透射电镜观察
6.5 讨论
6.6 小结
全文总结
本研究创新点
参考文献
致谢
个人简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]Review for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus[J]. Tao XING,Xingxing YU,Jun ZHANG,Hongfei ZHANG,Haigen WANG,Guangsheng ZHOU,Min ZHANG,Chuanmin LIU,Jingui LI. Agricultural Science & Technology. 2017(01)
博士论文
[1]猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究[D]. 李亮亮.西北农林科技大学 2018
本文编号：3432623
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：107 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展
1.1 PRRSV起源
1.2 PRRSV临床症状
1.3 PRRSV病理变化
1.4 PRRSV基因组组成
1.5 PRRSV非结构蛋白
1.6 PRRSV结构蛋白
1.7 PRRSV疫苗防控
第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒受体研究进展
2.1 CD163
2.2 非肌肉肌球蛋白重链 9(MYH9)
2.3 唾液酸黏附素(Sn)
2.4 其他受体分子
2.5 本研究的目的与意义
第三章 CD163与MYH9互作区域鉴定
3.1 实验材料
3.1.1 细胞,质粒和病毒
3.1.2 实验试剂与主要耗材
3.1.3 主要实验仪器设备
3.1.4 主要缓冲液配制
3.2 实验方法
3.2.1 免疫共沉淀实验验证PAMs内CD163与MYH9的互作
3.2.2 PAMs膜蛋白提取
3.2.3 免疫共沉淀实验验证CD163与MYH9的互作区域
3.2.4 Western Blot检测蛋白表达
3.2.5 原核表达系统表达纯化蛋白
3.2.6 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测SRCR1-4 与PRA蛋白的直接互作
3.2.7 Far-Western Blot检测SRCR1-4 与PRA的直接互作
3.2.8 Confocal验证重组表达的SRCR1-4 与PAMs细胞膜上MYH9的共定位
3.2.9 免疫共沉淀验证重组表达的SRCR1-4 与PAMs细胞膜上MYH9的互作
3.3 实验结果
3.3.1 CD163与MYH9在PAMs中相互作用
3.3.2 CD163蛋白的N端结构域SRCR1-4 与MYH9蛋白的C端区域PRA相互作用
3.3.3 SRCR1-4 蛋白表达与纯化
3.3.4 SRCR1-4 与PRA直接相互作用
3.3.5 SRCR1-4 蛋白与PAMs膜上分布的MYH9相互作用
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 SRCR1-4 与PRA的互作对PRRSV感染的影响
4.1 实验材料
4.1.1 细胞,质粒和病毒
4.1.2 实验试剂和主要耗材
4.1.3 主要实验仪器设备
4.2 实验方法
4.2.1 稳定表达CD163及其截短片段的HEK293T细胞系构建
4.2.2 免疫共沉淀检测HEK293T细胞系中CD163与MYH9的互作
4.2.3 PRRSV在HEK293T稳筛细胞系中吸附,内化,解离,复制过程的分析
4.2.4 PRRSV在HEK293TCD163,HEK293TSRCR1-4,HEK293TSRCR5-CT细胞系中的复制差异分析
4.3 实验结果
4.3.1 HEK293T~(CD163),HEK293T~(SRCR1-4),HEK293T~(SRCR5-CT)细胞系的建立与鉴定
4.3.2 HEK293T~(CD163),HEK293T~(SRCR1-4),HEK293T~(SRCR5-CT)细胞系中CD163与MYH9的互作
4.3.3 SRCR1-4 对于PRRSV在易感细胞内的入侵发挥重要作用
4.3.4 SRCR1-4 的表达影响PRRSV的复制效率
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 重组表达SRCR1-4 蛋白对PRRSV感染的抑制作用
5.1 实验材料
5.1.1 细胞,病毒和蛋白
5.1.2 实验试剂和主要耗材
5.1.3 主要仪器设备
5.2 实验方法
5.2.1 原核表达的SRCR1-4 蛋白对PRRSV在PAMs中内化的影响
5.2.2 不同浓度的SRCR1-4 蛋白孵育PAMs后对II型PRRSV的抑制作用
5.2.3 SRCR1-4 蛋白对细胞的毒性检测
5.2.4 重组SRCR1-4 蛋白对I,II型PRRSV的广谱性抑制作用
5.3 实验结果
5.3.1 重组SRCR1-4 蛋白抑制PRRSV在PAMs中的内化过程
5.3.2 重组SRCR1-4 蛋白对PRRSV具有广谱性抑制作用
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 CD163与MYH9互作区域的表达与纯化
6.1 实验材料
6.1.1 细胞与质粒
6.1.2 主要试剂耗材
6.1.3 主要实验仪器设备
6.3 实验方法
6.3.1 Far-Western Blot鉴定SRCR1-4 蛋白与截短PRA片段之间的互作
6.3.2 His-pull down检测SRCR1-4 与截短PRA蛋白之间的相互作用
6.3.3 SRCR1-4 与PRA互作区域的表达纯化
6.3.4 真核表达的PRA100与原核表达的SRCR1-4 蛋白之间的互作检测
6.3.5 稳定分泌表达 CD163 胞外区蛋白（SRCR1-PSTII）的 293s 悬浮细胞系构建
6.3.6 SRCR1-PSTII蛋白的纯化
6.3.7 SRCR1-PSTII蛋白透射电镜观察
6.4 实验结果
6.4.1 CD163 SRCR1-4 蛋白与PRA截短片段之间的互作
6.4.2 PRA100蛋白的表达纯化
6.4.3 真核表达的PRA100与原核表达SRCR1-4 蛋白之间的互作
6.4.4 CD163胞外区结构域SRCR1-PSTII蛋白的表达与纯化
6.4.5 SRCR1-PSTII透射电镜观察
6.5 讨论
6.6 小结
全文总结
本研究创新点
参考文献
致谢
个人简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]Review for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus[J]. Tao XING,Xingxing YU,Jun ZHANG,Hongfei ZHANG,Haigen WANG,Guangsheng ZHOU,Min ZHANG,Chuanmin LIU,Jingui LI. Agricultural Science & Technology. 2017(01)
博士论文
[1]猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究[D]. 李亮亮.西北农林科技大学 2018
本文编号：3432623
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3432623.html
