传染性法氏囊病病毒VP4蛋白磷酸化修饰的研究

发布时间：2021-10-13 20:09

　　传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属成员,主要侵害雏鸡体液免疫中枢器官法氏囊中的B淋巴细胞前体。IBDV基因组由分节段的A、B片段组成,分别编码RNA依赖的RNA聚合酶VP1、衣壳蛋白VP2与VP3、病毒自身的蛋白酶VP4以及非结构蛋白VP5五种蛋白。目前VP4蛋白除作为一种病毒蛋白酶被认识外,其他一无所知,本研究分析了IBDV感染细胞内VP4蛋白的磷酸化修饰及功能。以杆状病毒表达的IBDV-VP4蛋白为免疫原,免疫6-8周龄雌性BALB/C小鼠,以HAT筛选培养基进行选择培养,以相应的偶联多肽和IBDV感染细胞进行ELISA和IFA筛选,结果获得6株稳定分泌的单克隆抗体细胞株4A8、5B2、5C7、5C9、7A4和7H8。亚型鉴定结果显示它们都是IgGl亚类,轻链为K型。结合表位预测与合成肽技术,鉴定出4A8、5B2、5C7三株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体共同识别磷酸化抗原表位VP4-Ser26,而杂交瘤细胞5C9分泌的单克隆抗体识别非磷酸化抗原表位12FQVPQNPVVDGILASPGVLR... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：170 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
论文创新点
摘要
Abstract
技术路线
第一部分 文献综述
    第一章 传染性法氏囊病病毒的研究动态
        1 IBDV的病毒学分类地位
        2 IBDV的基因组结构和编码蛋白
            2.1 非编码区结构和功能研究
            2.2 RNA依赖的RNA聚合酶VP1蛋白
            2.3 pVP2、VP2以及4条多肽
            2.4 衣壳蛋白VP3
            2.5 蛋白酶蛋白VP4
            2.6 非结构蛋白VP5
        3 病毒蛋白、dsRNA之间的相互关系与病毒粒子的组装
        4 IBDV的致病性和毒力差异
        5 IBDV和宿主相互作用关系研究
        6 IBDV编码蛋白抗原表位研究进展
    第二章 病毒蛋白磷酸化的研究进展
        1 病毒蛋白磷酸化与病毒的复制
        2 病毒蛋白磷酸化与病毒蛋白的位移
        3 病毒蛋白磷酸化与病毒的组装
        4 病毒蛋白磷酸化与细胞信号通路
        5 病毒蛋白磷酸化的其它功能
第二部分 研究内容
    第一章 传染性法氏囊病病毒VP4蛋白抗原表位分析
        摘要
        1 材料
            1.1 病毒与细胞
            1.2 试剂与抗体
        2 实验方法
            2.1 小鼠免疫
            2.2 饲养细胞的准备
            2.3 骨髓瘤细胞制备
            2.4 免疫脾细胞制备
            2.5 细胞融合
            2.6 杂交瘤细胞的筛选及克隆化
            2.7 单抗腹水的制备
            2.8 单抗腹水ELISA效价的测定
            2.9 IFA鉴定单克隆抗体的反应性以及IFA效价的测定
            2.10 单克隆抗体的Ig亚型测定
            2.11 单克隆抗体的Western-blot鉴定
                2.11.1 样品准备
                2.11.2 蛋白浓度的测定
                2.11.3 SDS-PAGE及Western-blot
            2.12 VP4蛋白抗原表位的精细定位
                2.12.1 包含抗原表位以及磷酸化修饰的多肽设计与合成
                2.12.2 多肽的溶解与保存
                2.12.3 多肽与载体蛋白的偶联
                2.12.4 偶联多肽的透析
                2.12.5 Peptide-ELISA
                2.12.6 Peptide-Dot-ELISA
        3 结果与分析
            3.1 单抗细胞建株
            3.2 单克隆抗体特异性和反应性鉴定
            3.3 单抗腹水的ELISA效价、IFA效价及亚型鉴定
            3.4 IBDV VP4蛋白单克隆抗体的抗原表位鉴定
            3.5 磷酸化单抗和非磷酸化单抗反应差异性比较
            3.6 制备的磷酸化单抗与商业化通用型磷酸化单抗的比较
            3.7 表位的同源性分析
        4 讨论
    第二章 传染性法氏囊病病毒VP4蛋白磷酸化修饰的细胞内分布与功能分析
        摘要
        1 材料
            1.1 病毒、细胞、载体和抗体
            1.2 试剂、材料和仪器
        2 方法
            2.1 磷酸化和非磷酸化VP4蛋白在细胞中分布
                2.1.1 间接免疫荧光双标检测IBDV感染DF-1细胞中VP4分布
                2.1.2 直接免疫荧光双标法检测IBDV感染DF-1细胞VP4分布
                2.1.3 IFA检测重组杆状病毒rBV-aVP4、pVP4感染High 5细胞中VP4分布
            2.2 免疫共沉淀
            2.3 去磷酸化对VP4蛋白分布的影响
                2.3.1 点突变载体构建
                2.3.2 带有点突变的超纯质粒抽提
                2.3.3 脂质体介导的转染以及蛋白表达检测
            2.4 VP4去磷酸化后多聚蛋白VP243在细胞内的表达
                2.4.1 多聚蛋白VP243重组真核表达载体的构建
                2.4.2 超纯质粒抽提
                2.4.3 质粒转染293T细胞以及样品制备
                2.4.4 SDS-PAGE和Western blot分析
            2.5 VP4蛋白去磷酸化后多聚蛋白VP243体外的转录翻译
                2.5.1 超纯质粒抽提
                2.5.2 体外转录翻译
                2.5.3 SDS-PAGE和Western blot分析
            2.6 SDS-PAGE以及Western-blot检测杆状病毒表达VP4蛋白
            2.7 细胞蛋白组分的分步抽提以及Western blot分析
                2.7.1 细胞蛋白的分步抽提
                2.7.2 抽提蛋白的丙酮沉淀
                2.7.3 蛋白浓度的测定
                2.7.4 SDS-PAGE以及Western-blot
            2.8 荧光定量PCR检测病毒编码蛋白对细胞骨架相关蛋白的影响
                2.8.1 引物设计
                2.8.2 超纯质粒抽提
                2.8.3 脂质体介导的转染
                2.8.4 细胞总RNA的抽提
                2.8.5 反转录
                2.8.6 Real-time PCR与数据分析
        3 结果与分析
            3.1 磷酸化和非磷酸化VP4蛋白在病毒感染细胞中的分布
                3.1.1 IBDV感染DF-1细胞中VP4蛋白的分布
                3.1.2 杆状病毒表达的VP4蛋白在High5细胞中的分布情况
            3.2 点突变真核表达载体构建
            3.3 去磷酸化点突变VP4在转染细胞中的表达动态
            3.4 VP4多位点去磷酸化后多聚蛋白VP243的表达
            3.5 VP4多位点去磷酸化突变的VP243的体外转录翻译
            3.6 VP4蛋白的亚细胞分布
                3.6.1 磷酸化VP4蛋白在IBDV感染的DF-1细胞中的亚细胞分布
                3.6.2 磷酸化VP4蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9细胞中的亚细胞分布
            3.7 IBDV编码蛋白对细胞骨架相关蛋白的转录本的影响
        4 讨论
            4.1 IBDV VP4蛋白是一种磷酸化蛋白
            4.2 四个磷酸化位点对VP4蛋白定位和分布的影响
            4.3 Tyr99和Thr162位点对VP4蛋白剪切功能的影响
            4.4 VP4蛋白主要存在于细胞骨架组分中
            4.5 VP4蛋白对细胞骨架相关蛋白转录本的影响
    第三章 VP4与IBDV其它编码蛋白的互作研究
        摘要
        1 材料
            1.1 试剂
            1.2 单克隆抗体和多克隆抗体
            1.3 细胞、病毒和载体
        2 方法
            2.1 转染用超纯质粒抽提
            2.2 脂质体介导的细胞转染
            2.3 间接免疫荧光(IFA)
            2.4 免疫荧光双标
            2.5 免疫共沉淀
        3 结果与分析
            3.1 VP4蛋白与其它IBDV编码蛋白在细胞中的定位关系
                3.1.1 VP4与VP1的共定位
                3.1.2 VP4与VP2的共定位
                3.1.3 VP4与VP3的共定位
                3.1.4 VP4与VP5的共定位
                3.1.5 VP2与VP3的共定位
                3.1.6 VP2、VP3以及VP4的共定位
            3.2 免疫共沉淀分析VP4蛋白与VP1、VP3蛋白的关系
                3.2.1 病毒感染情况下非磷酸化VP4蛋白与VP1、VP3蛋白的关系
                3.2.2 病毒感染情况下pS26-VP4蛋白与VP1、VP3蛋白的关系
                3.2.3 质粒转染情况下VP4蛋白与VP3蛋白的相互关系
        4 讨论
全文总结
参考文献
第三部分 附录
    附录A 缩略词
    附录B 常用缓冲液及培养基配方
    附录C 攻博期间发表或录用的学术论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]传染性法氏囊病毒的抗原及分子特征(英文)[J]. 周继勇,叶菊秀,叶伟成,陈庆新,郑肖娟,郭军庆.  生物化学与生物物理进展. 2005(01)

硕士论文
[1]A组羊轮状病毒LLR VP4单克隆抗体的制备与特性研究[D]. 王三应.华中师范大学 2009
[2]传染性法氏囊病病毒VP2、VP3蛋白抗原表位分析与定位研究[D]. 邓小芸.中国农业科学院 2007
[3]抗鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的制备及抗原表位初步分析[D]. 程宇.新疆农业大学 2006



本文编号：3435330