猪zfx基因RNAi片段的筛选及性控效果的观察
发布时间：2021-10-15 17:05
X染色体耦联锌指蛋白（zinc finger protein，X-linked，Zfx）是锌指蛋白家族中的一员，Zfx基因是睾丸决定因子（Testis Determining Factor，TDF）的候选基因。Zfx/Zfy是位于哺乳动物X染色体和Y染色体上的一对等位基因，Zfx基因是含有的锌指结构，该结构特点使锌指蛋白可以选择性地结合特异的靶基因，引导靶基因穿过核膜，定位于精子细胞核内，在精子形成过程中具有一定功能。RNA干扰（RNA interference,RNAi）转录后水平基因沉默（post transcriptional genesilence, PTGS）现象，是内源性或导入人工合成的小分子双链RNA特异性降解与其同源的mRNA的过程，而后形成2025个碱基大小的小干扰RNA，在mRNA水平上阻断体内特异性基因表达的现象。目的：本实验希望将RNAi技术与猪的性别控制结合起来，人为对zfx基因的表达进行干扰，使X精子的发育和生成受阻或影响X精子的活性和受精能力，从而获得较高的雄性后代。方法：依照siRNA的设计原则，构建针对猪zfx基因的干扰载体，经过...
【文章来源】：石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pLL3.7质粒的多克隆插入位点Fig2PLL3.7plasmidpolyclonalenzymeloci
iRNA 序列的设计验猪 zfx 基因的 mRNA 序列来自于美国国立生物技术信息中心基因ank，NCBI），基因编码为 XM-003134981.3。将 zfx 基因的编码区提交到 GeneLi//www.genelink.com/sirna/RNAicustomorder.asp ）、 WIsiRNA SelectionProgr图 2.pLL3.7 质粒的多克隆插入位点Fig 2 PLL3.7 plasmid polyclonal enzyme loci图 1. RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-ZsGreen 的限制图谱和克隆位点Fig 1.The Restriction Map and Cloning Site of RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-ZsGreen
内其他基因进行同源性比对。3) a、pSIREN 质粒载体 siRNA 序列的设计:在 siRNA 序列正义链 5’端加入 BamH I(GATCC)，在 3’端加上 Loop 环TTCAAGAGA），使寡核苷酸序列能在解链后形成发夹结构（图 3），再加入正义链的向互补序列，加终止信号 6 个 T，最后加上 EcoR I (CTTAAG)，形成酶切位点(BamH I)+义链+loop 环+反义链+终止信号+酶切位点(EcoR I)的（图 4）。如此便设计好了完整的RNA。pSIREN 质粒载体 siRNA 序列的 5’端和 3’端均为酶粘性末端。在设计 pSIREN 质粒的空载体 siRNA 序列时，选乱序重排的序列，该序列也经LAST，与猪的任何基因无同源性，此后按前面的步骤设计完整的寡合苷酸序列。b、e 质粒载体 siRNA 序列的设计:在 siRNA 序列正义链 5’端加 T 重建 U6 启动子-1 位的 T,在 3’端加上 Loop 环TTCAAGAGA），加入反向互补序列，加入 RNApolymerase 的终止信号 6 个 T，再加 XhoI（CTCGAG）的粘性末端，由此构建 shRNA 表达的插入序列。序列 5’端为 HpaI切酶(GTTAAC)为平末端，3’端为 Xho I 内切酶（CTCGAG）为粘性末端。4) 初步筛选出 5 个 shRNA 寡核苷酸序列，均委托上海生工生物工程技术服务有限司进行人工合成，并经 PAGE 纯化。
【参考文献】：
期刊论文
[1]高效抑制小鼠精子zfx基因shRNA分子的筛选[J]. 马世俊,马军德,贾斌,申红,王绪海,张挺军,郭玉强,蔡国宝. 石河子大学学报(自然科学版). 2013(04)
[2]RNA干扰机制在治疗HIV上的应用[J]. 殷实. 医学理论与实践. 2010(03)
[3]X、Y精子分离纯度评价方法的研究进展[J]. 郭家明,朱化彬,王栋,张林波,郝海生,杜卫华. 遗传. 2008(09)
[4]流式细胞仪在猪性别控制中的应用初探[J]. 曾有权,陆阳清,牛金涛,黎江,蓝海恩,潘天彪,张明,蒙冰,卢克焕. 安徽农业科学. 2006(18)
[5]ICR小鼠胚胎及生后不同阶段睾丸内生殖细胞的发育[J]. 卢晅,周新华. 武汉大学学报(医学版). 2004(04)
[6]性别决定机理与性别鉴定的研究进展[J]. 张秀华,吴登俊. 中国畜牧兽医. 2004(07)
[7]小鼠睾丸精子细胞的分离与鉴定[J]. 朱培元,黄宇烽,徐建平. 中华男科学. 2002(01)
[8]与性别有关的镉元素[J]. 白海湖. 榆林高等专科学校学报. 1999(02)
[9]奶牛的精液分离及性控试验[J]. 吴伟,陈元明,刘润铮,王光辉,黄美玉,孙姝芬. 内蒙古农牧学院学报. 1998(03)
本文编号：3438322
【文章来源】：石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pLL3.7质粒的多克隆插入位点Fig2PLL3.7plasmidpolyclonalenzymeloci
iRNA 序列的设计验猪 zfx 基因的 mRNA 序列来自于美国国立生物技术信息中心基因ank，NCBI），基因编码为 XM-003134981.3。将 zfx 基因的编码区提交到 GeneLi//www.genelink.com/sirna/RNAicustomorder.asp ）、 WIsiRNA SelectionProgr图 2.pLL3.7 质粒的多克隆插入位点Fig 2 PLL3.7 plasmid polyclonal enzyme loci图 1. RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-ZsGreen 的限制图谱和克隆位点Fig 1.The Restriction Map and Cloning Site of RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-ZsGreen
内其他基因进行同源性比对。3) a、pSIREN 质粒载体 siRNA 序列的设计:在 siRNA 序列正义链 5’端加入 BamH I(GATCC)，在 3’端加上 Loop 环TTCAAGAGA），使寡核苷酸序列能在解链后形成发夹结构（图 3），再加入正义链的向互补序列，加终止信号 6 个 T，最后加上 EcoR I (CTTAAG)，形成酶切位点(BamH I)+义链+loop 环+反义链+终止信号+酶切位点(EcoR I)的（图 4）。如此便设计好了完整的RNA。pSIREN 质粒载体 siRNA 序列的 5’端和 3’端均为酶粘性末端。在设计 pSIREN 质粒的空载体 siRNA 序列时，选乱序重排的序列，该序列也经LAST，与猪的任何基因无同源性，此后按前面的步骤设计完整的寡合苷酸序列。b、e 质粒载体 siRNA 序列的设计:在 siRNA 序列正义链 5’端加 T 重建 U6 启动子-1 位的 T,在 3’端加上 Loop 环TTCAAGAGA），加入反向互补序列，加入 RNApolymerase 的终止信号 6 个 T，再加 XhoI（CTCGAG）的粘性末端，由此构建 shRNA 表达的插入序列。序列 5’端为 HpaI切酶(GTTAAC)为平末端，3’端为 Xho I 内切酶（CTCGAG）为粘性末端。4) 初步筛选出 5 个 shRNA 寡核苷酸序列，均委托上海生工生物工程技术服务有限司进行人工合成，并经 PAGE 纯化。
【参考文献】：
期刊论文
[1]高效抑制小鼠精子zfx基因shRNA分子的筛选[J]. 马世俊,马军德,贾斌,申红,王绪海,张挺军,郭玉强,蔡国宝. 石河子大学学报(自然科学版). 2013(04)
[2]RNA干扰机制在治疗HIV上的应用[J]. 殷实. 医学理论与实践. 2010(03)
[3]X、Y精子分离纯度评价方法的研究进展[J]. 郭家明,朱化彬,王栋,张林波,郝海生,杜卫华. 遗传. 2008(09)
[4]流式细胞仪在猪性别控制中的应用初探[J]. 曾有权,陆阳清,牛金涛,黎江,蓝海恩,潘天彪,张明,蒙冰,卢克焕. 安徽农业科学. 2006(18)
[5]ICR小鼠胚胎及生后不同阶段睾丸内生殖细胞的发育[J]. 卢晅,周新华. 武汉大学学报(医学版). 2004(04)
[6]性别决定机理与性别鉴定的研究进展[J]. 张秀华,吴登俊. 中国畜牧兽医. 2004(07)
[7]小鼠睾丸精子细胞的分离与鉴定[J]. 朱培元,黄宇烽,徐建平. 中华男科学. 2002(01)
[8]与性别有关的镉元素[J]. 白海湖. 榆林高等专科学校学报. 1999(02)
[9]奶牛的精液分离及性控试验[J]. 吴伟,陈元明,刘润铮,王光辉,黄美玉,孙姝芬. 内蒙古农牧学院学报. 1998(03)
本文编号：3438322
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