应用CRISPR/Cas9系统终止禽内源性白血病病毒ALVE1表达及其功能初探
发布时间：2021-10-17 05:50
据称,内源性反转录病毒（Endogenous retroviruses,ERVs）是远古反转录病毒感染时留下的痕迹,构成了机体“virome”的重要组成部分。过去对内源性反转录病毒的功能不够了解,曾将其视为“垃圾DNA”（JunkDNA）。但最近有研究表明,某些内源性反转录病毒不仅对早期胚胎发育和胚胎干细胞的多能性具有重要作用,还可能与病毒感染、天然免疫以及抗肿瘤作用有关。本研究选择内源性反转录病毒一鸡内源性白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup E,ALVE）作为研究模型,应用CRISPR/Cas9系统对鸡1号染色体上存在的内源性反转录病毒ALVE1进行去表达以探索其与天然免疫之间的关系,为进一步研究内源性反转录病毒的功能和作用奠定基础。本研究通过CRISPR/Cas9技术将转录终止序列（SV40ployA）敲入内源性反转录病毒ALVE1的启动子区,通过终止其转录从而实现ALVE1的去功能（Loss of function）。本文不仅成功构建了针对家禽内源性反转录病毒去功能研究的新方法,还为今后研究内源性反转录病毒的功能提供了新思路。主要的研究结果如下...
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?ＣＲＩＳＰＲ系统结构??Ｆｉｇ．?１－１?ＣＲＩＳＰＲ?ｓｙｓｔｅｍ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统介导的基因定点编辑技术是目前基因编辑领域比较热门的方法，通过??对原始的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统简单的改造，实现了在多种生物中高度灵活且特异的基因组编??辑，如图１－３所示。在ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ的三种系统中，比较简单的是ＩＩ型系统，对其研宄的??也比较透彻。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统在抵御外源噬菌体的侵入时，Ｃａｓ家族蛋白只有Ｃａｓ９??蛋白参与。成熟的ｃｒＲＮＡ与ｔｒａｃｒＲＮＡ结合，形成嵌合体ＲＮＡ分子，称为向导ＲＮＡ（Ｓｉｎｇｌｅ??ｇｕｉｄｅＲＮＡ，ｓｇＲＮＡ），ｓｇＲＮＡ具有定位的功能，它与靶序列上的ＤＮＡ序列进行互补配??对，实现特异性的定点修饰。在ｓｇＲＮＡ的介导下，Ｃａｓ９蛋白识别ＰＡＭ序列，在目的基因??处产生切割，形成ＤＳＢ缺口，启动基因组的自我修复机制，进行非同源末端连接以及同源??重组修复，最终实现对基因组基因的定点敲除、特异突变引入以及定点修饰。??
２．１禽内源性白血病病毒ＡＬＶＥ１的序列分析??根据ＮＣＢＩ上公布的序列信息，对本章材料与方法部分１．４．１表１中的所有序列进行同??源性和进化树分析，结果如图２－１所示。结果显示：禽内源性白血病病毒ＡＬＶＥ１序列与禽??外源性白血病病毒的不同亚群之间高度同源，达到８５％以上。??Ａ??ｔｉｌｌ??ＡＬＶＡ．ＲＳＡ????Ｉ?—??！Ｊｉ班ｊ?■■丨＂■？??■ＡＬ’Ｏｇｕｓ．，??■■■■■■＂??ＡｌＡＶＸ?ｉ???」——————??ＡｔＷ?—Ｊ??１?妨??Ａｉ．ｖ－３ｊｍＧｒｉ??Ｍ??ｊａｖ．？＿ＮＤｉＧ｝ｅｊ??Ｊ??Ｂ??１００?ＡＬＶＥ?ｅｖ－１??湖［?＾?ＡＬＹＥ?ＳＤ０５０１?－??？￣ｆＸ?＾?ＡＬＶＡ?ＳＤＡＵ０３Ｅ１??９８?；??ＡＬＶＡ?ＲＳＡ???ＡＬＶＣ?Ｐｒａｇｕｅ?Ｃ??：＿＿?ｒ?－?—？?ＡＬＶＢ?Ｓｃｈｍｉｄｔ＇Ｒｕｐｐｉｎ?Ｂ??７，ｌｊ■—ＡＬ＼／Ｄ?Ｓｃｈｍｉｄｔ－Ｒｕｐｐｉｎ?Ｄ??ｉ—??…Ａ
【参考文献】：
期刊论文
[1]基因组编辑技术在植物中的研究进展与应用前景[J]. 谢科,饶力群,李红伟,安学丽,方才臣,万向元. 中国生物工程杂志. 2013(06)
[2]CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化[J]. 李铁民,杜波. 遗传. 2011(03)
[3]禽白血病病毒特性的研究进展[J]. 郝春丽,胡梅,柴建亭. 上海畜牧兽医通讯. 2010(01)
[4]真核mRNA转录终止机制[J]. 郭晓强,王江雁,王仁杰. 细胞生物学杂志. 2005(04)
[5]J亚群禽白血病病毒研究进展[J]. 杨玉莹. 中国病毒学. 2003(01)
博士论文
[1]SV40PolyA活化基因元件突变影响GFP报告基因表达[D]. 王红钢.河北医科大学 2011
本文编号：3441232
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?ＣＲＩＳＰＲ系统结构??Ｆｉｇ．?１－１?ＣＲＩＳＰＲ?ｓｙｓｔｅｍ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统介导的基因定点编辑技术是目前基因编辑领域比较热门的方法，通过??对原始的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统简单的改造，实现了在多种生物中高度灵活且特异的基因组编??辑，如图１－３所示。在ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ的三种系统中，比较简单的是ＩＩ型系统，对其研宄的??也比较透彻。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统在抵御外源噬菌体的侵入时，Ｃａｓ家族蛋白只有Ｃａｓ９??蛋白参与。成熟的ｃｒＲＮＡ与ｔｒａｃｒＲＮＡ结合，形成嵌合体ＲＮＡ分子，称为向导ＲＮＡ（Ｓｉｎｇｌｅ??ｇｕｉｄｅＲＮＡ，ｓｇＲＮＡ），ｓｇＲＮＡ具有定位的功能，它与靶序列上的ＤＮＡ序列进行互补配??对，实现特异性的定点修饰。在ｓｇＲＮＡ的介导下，Ｃａｓ９蛋白识别ＰＡＭ序列，在目的基因??处产生切割，形成ＤＳＢ缺口，启动基因组的自我修复机制，进行非同源末端连接以及同源??重组修复，最终实现对基因组基因的定点敲除、特异突变引入以及定点修饰。??
２．１禽内源性白血病病毒ＡＬＶＥ１的序列分析??根据ＮＣＢＩ上公布的序列信息，对本章材料与方法部分１．４．１表１中的所有序列进行同??源性和进化树分析，结果如图２－１所示。结果显示：禽内源性白血病病毒ＡＬＶＥ１序列与禽??外源性白血病病毒的不同亚群之间高度同源，达到８５％以上。??Ａ??ｔｉｌｌ??ＡＬＶＡ．ＲＳＡ????Ｉ?—??！Ｊｉ班ｊ?■■丨＂■？??■ＡＬ’Ｏｇｕｓ．，??■■■■■■＂??ＡｌＡＶＸ?ｉ???」——————??ＡｔＷ?—Ｊ??１?妨??Ａｉ．ｖ－３ｊｍＧｒｉ??Ｍ??ｊａｖ．？＿ＮＤｉＧ｝ｅｊ??Ｊ??Ｂ??１００?ＡＬＶＥ?ｅｖ－１??湖［?＾?ＡＬＹＥ?ＳＤ０５０１?－??？￣ｆＸ?＾?ＡＬＶＡ?ＳＤＡＵ０３Ｅ１??９８?；??ＡＬＶＡ?ＲＳＡ???ＡＬＶＣ?Ｐｒａｇｕｅ?Ｃ??：＿＿?ｒ?－?—？?ＡＬＶＢ?Ｓｃｈｍｉｄｔ＇Ｒｕｐｐｉｎ?Ｂ??７，ｌｊ■—ＡＬ＼／Ｄ?Ｓｃｈｍｉｄｔ－Ｒｕｐｐｉｎ?Ｄ??ｉ—??…Ａ
【参考文献】：
期刊论文
[1]基因组编辑技术在植物中的研究进展与应用前景[J]. 谢科,饶力群,李红伟,安学丽,方才臣,万向元. 中国生物工程杂志. 2013(06)
[2]CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化[J]. 李铁民,杜波. 遗传. 2011(03)
[3]禽白血病病毒特性的研究进展[J]. 郝春丽,胡梅,柴建亭. 上海畜牧兽医通讯. 2010(01)
[4]真核mRNA转录终止机制[J]. 郭晓强,王江雁,王仁杰. 细胞生物学杂志. 2005(04)
[5]J亚群禽白血病病毒研究进展[J]. 杨玉莹. 中国病毒学. 2003(01)
博士论文
[1]SV40PolyA活化基因元件突变影响GFP报告基因表达[D]. 王红钢.河北医科大学 2011
本文编号：3441232
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