减毒大肠杆菌作为口服疫苗投递载体的研究
发布时间：2021-10-20 00:51
肠致病性大肠杆菌（ E. coil）引起的仔猪腹泻是危害养猪业的重要疾病之一。主要表现为严重的腹泻、脱水,并导致大批仔猪死亡,严重影响仔猪的成活率。由于E. coli耐药菌株的不断出现,导致药物治疗的效果越来越差,因此研制有效预防仔猪大肠杆菌性腹泻的疫苗对预防该病的发生具有重要的实际意义。肠致病性E. coli的流行情况复杂,其携带的毒力因子在不同的国家或地区的流行情况不同,即使在同一地区,毒力因子在不同年份的流行情况也有差别。本研究旨在对近年肠致病性E. coli毒力基因分布进行调查,为疫苗抗原基因的选择提供依据：根据仔猪大肠杆菌性腹泻的感染特点,探索以减毒大肠杆菌作为口服疫苗投递载体的可行性。本研究从38个规模化猪场采集了290份粪便样品,从中分离得到了381株E. coli,对E. coli分离株进行了毒力因子菌毛（K88、K99、987P、F41、F18、F17）、非菌毛黏附因子（AIDA-I, paa, CS31A, eae, saa）,肠毒素（LT-Ⅰ、LT-Ⅱ、STa、STb、EAST1 ）,志贺毒素（Stx1、Stx2、Stx2e）、毒力岛（HPI、LEE）、a-溶血素...
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：181 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
1 引言
1.1 猪源肠致病性E.coli的主要毒力因子
1.1.1 肠毒素
1.1.2 黏附因子
1.1.3 其他毒力因子
1.2 E.coli同源重组技术
1.2.1 自杀载体法
1.2.2 “线性片段”的方法
1.3 肠致病性E.coli疫苗
1.3.1 灭活疫苗
1.3.2 粘附素类疫苗
1.3.3 基因工程疫苗
1.4 细菌活载体疫苗
1.4.1 减毒沙门氏菌疫苗
1.4.2 重组BCG载体疫苗
1.4.3 重组乳酸菌载体疫苗
1.4.4 志贺菌载体疫苗
1.4.5 李斯特菌载体疫苗
1.4.6 大肠杆菌载体疫苗
1.5 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 病料
2.1.2 菌株
2.1.3 PCR引物
2.1.4 载体
2.1.5 实验动物及细胞系
2.1.6 主要试剂
2.1.7 ELISA包被抗原
2.1.8 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 仔猪腹泻粪便中E.coli的流行病学调查
2.2.2 E.coli O142的部分生物学特性鉴定
2.2.3 E.coli O142减毒菌株的构建
2.2.4 基于λ噬菌体Kil基因的E.coli双向筛选平台的构建
2.2.5 基于红色荧光蛋白mKate2基因的E.coli双向筛选平台的构建
2.2.6 利用双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-Kil)构建重组菌株ER-A
2.2.7 利用双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-mKate2)构建重组菌株ER-B
2.2.8 重组E.coli ER-A及ER-B作为口服疫苗的可行性分析
2.2.9 重组E.coli ER-A及ER-B对小鼠的免疫学指标测定
2.2.10 重组E.coli ER-A及ER-B对猪的免疫学指标测定
3 结果
3.1 流行病学调查结果
3.1.1 E.coli的分离与鉴定
3.1.2 E.coli毒力因子的PCR检测
3.1.3 肠毒素相关基因的分离情况
3.1.4 菌毛及非菌毛粘附因子基因的分离情况
3.1.5 毒力因子的分布及特征
3.1.6 毒力因子在不同地区的分布情况
3.2 E.coli O142的鉴定
3.2.1 E.coli O142菌株的鉴定
3.2.2 E.coli O142菌毛的电镜观察
3.2.3 E.coli O142对ZYM-DIEC02细胞的毒性作用
3.2.4 E.coli O142对乳鼠的毒性
3.3 减毒E.coli O142：ΔSTa的构建及鉴定
3.3.1 抗性基因Kan的扩增
3.3.2 重组载体pSTa中Kan基因的检测
3.3.3 减毒E coli O142：ΔSTa的鉴定
3.3.4 减毒E.coli O142：ΔSTa对ZYM-DIEC02细胞的毒性作用
3.3.5 减毒E.coli O142：ΔSTa对乳鼠的毒性
3.4 基于Kil基因的E.coli双向筛选平台的构建及鉴定
3.4.1 噬菌体Kil基因的扩增
3.4.2 CIts857-PRPL启动子序列的扩增
3.4.3 rrnB转录终止子基因的扩增
3.4.4 CIts857-PRPL-Kil-rrnB操纵子的鉴定
3.4.5 假基因yaiT同源臂的扩增
3.4.6 pKil-donor载体的鉴定
3.4.7 双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-Kil)的PCR鉴定
3.4.8 双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-Kil)的验证
3.5 基于mKate2基因的E.coli双向筛选平台的构建及验证
3.5.1 红色荧光蛋白mKate2基因的扩增
3.5.2 CIts857-PRPL-mKate2-rrnB操纵子的鉴定
3.5.3 pmKate2-Donor载体的鉴定
3.5.4 双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-mKate2)的PCR鉴定
3.5.5 双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-mKate2)的验证
3.6 递呈LT192-STa13嵌合蛋白的重组菌株ER-A的构建及鉴定
3.6.1 LT192-STa13嵌合类毒素基因的构建及鉴定
3.6.2 pL-S-Donor载体的鉴定
3.6.3 重组菌株ER-A的PCR鉴定
3.6.4 重组E.coli ER-A中LT192-STa13蛋白的Western blot分析
3.7 递呈LT192-STb嵌合蛋白的重组菌株ER-B的构建及鉴定
3.7.1 LT192-STb嵌合类毒素基因的构建及鉴定
3.7.2 重组打靶载体pL-S-Donor载体的鉴定
3.7.3 重组菌株ER-B的PCR鉴定
3.7.4 重组E.coli ER-B中LT192-STb蛋白的Western blot分析
3.8 E.coli ER-A及ER-B作为口服疫苗递呈抗原载体的可行性评价
3.8.1 ER-A及ER-B对ZYM-DIEC02细胞的毒性
3.8.2 ER-A及ER-B对乳鼠的毒性
3.8.3 ER-A及ER-B对胃液环境的耐受性
3.8.4 ER-A及ER-B对肠液环境耐受性
3.8.5 ER-A及ER-B对胆汁的耐受性
3.8.6 ER-A及ER-B的口服安全性
3.8.7 ER-A及ER-B的生长曲线
3.8.8 ER-A及ER-B的电镜观察
3.8.9 ER-A及ER-B的遗传稳定性
3.8.10 ER-A及ER-B的定植能力
3.9 重组E.coli ER-A及ER-B对小鼠的口服免疫效果测定
3.9.1 免疫小鼠特异性抗体IgG测定
3.9.2 免疫小鼠特异性抗体sIgA测定
3.9.3 淋巴细胞增殖结果
3.9.4 Th1和Th2细胞亚类的检测
3.9.5 体外中和试验
3.9.6 乳鼠体内中和试验
3.9.7 乳鼠攻毒保护试验
3.10 重组菌株对猪的口服免疫效果测定
3.10.1 ER-A及ER-B在猪肠道内的定植能力
3.10.2 免疫猪特异性抗体IgG测定
3.10.3 免疫猪特异性抗体sIgA测定
3.10.4 猪淋巴细胞增殖结果
3.10.5 Th1和Th2细胞亚类的检测
3.10.6 体外中和试验
3.10.7 乳鼠体内中和试验
3.10.8 攻毒保护试验
4 讨论
4.1 猪源肠致病性E.coli流行情况
4.1.1 黏附因子分离率及分布特征
4.1.2 肠毒素和黏附因子之间的关系
4.1.3 肠毒素基因的流行特点
4.1.4 耶尔森毒力岛的流行特点
4.2 E.coli双向筛选平台的构建
4.2.1 同源重组方法的选择
4.2.2 Kil及mKate2操纵子的优势
4.2.3 选择假基因yaiT作为外源序列插入位点的理由
4.3 ER-A及ER-B作为口服疫苗候选菌株的可行性分析
4.3.1 口服疫苗对肠致病性E.coli进行免疫防控的优势
4.3.2 肠致病性E.coli疫苗的设计
4.3.3 用LT192-STa13和LT192-STb嵌合类毒素作为靶抗原的优势
4.3.4 ER-A及ER-B的主要生物学特性
4.4 ER-A和ER-B的免疫效果
4.5 本研究的局限和不足之处
4.6 重组细菌活载体疫苗的发展方向及可能存在的问题
5 结论
致谢
参考文献
攻读博士学位期间发表的学术论文
本文编号：3445925
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：181 页
【学位级别】：博士
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中文摘要
英文摘要
1 引言
1.1 猪源肠致病性E.coli的主要毒力因子
1.1.1 肠毒素
1.1.2 黏附因子
1.1.3 其他毒力因子
1.2 E.coli同源重组技术
1.2.1 自杀载体法
1.2.2 “线性片段”的方法
1.3 肠致病性E.coli疫苗
1.3.1 灭活疫苗
1.3.2 粘附素类疫苗
1.3.3 基因工程疫苗
1.4 细菌活载体疫苗
1.4.1 减毒沙门氏菌疫苗
1.4.2 重组BCG载体疫苗
1.4.3 重组乳酸菌载体疫苗
1.4.4 志贺菌载体疫苗
1.4.5 李斯特菌载体疫苗
1.4.6 大肠杆菌载体疫苗
1.5 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 病料
2.1.2 菌株
2.1.3 PCR引物
2.1.4 载体
2.1.5 实验动物及细胞系
2.1.6 主要试剂
2.1.7 ELISA包被抗原
2.1.8 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 仔猪腹泻粪便中E.coli的流行病学调查
2.2.2 E.coli O142的部分生物学特性鉴定
2.2.3 E.coli O142减毒菌株的构建
2.2.4 基于λ噬菌体Kil基因的E.coli双向筛选平台的构建
2.2.5 基于红色荧光蛋白mKate2基因的E.coli双向筛选平台的构建
2.2.6 利用双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-Kil)构建重组菌株ER-A
2.2.7 利用双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-mKate2)构建重组菌株ER-B
2.2.8 重组E.coli ER-A及ER-B作为口服疫苗的可行性分析
2.2.9 重组E.coli ER-A及ER-B对小鼠的免疫学指标测定
2.2.10 重组E.coli ER-A及ER-B对猪的免疫学指标测定
3 结果
3.1 流行病学调查结果
3.1.1 E.coli的分离与鉴定
3.1.2 E.coli毒力因子的PCR检测
3.1.3 肠毒素相关基因的分离情况
3.1.4 菌毛及非菌毛粘附因子基因的分离情况
3.1.5 毒力因子的分布及特征
3.1.6 毒力因子在不同地区的分布情况
3.2 E.coli O142的鉴定
3.2.1 E.coli O142菌株的鉴定
3.2.2 E.coli O142菌毛的电镜观察
3.2.3 E.coli O142对ZYM-DIEC02细胞的毒性作用
3.2.4 E.coli O142对乳鼠的毒性
3.3 减毒E.coli O142：ΔSTa的构建及鉴定
3.3.1 抗性基因Kan的扩增
3.3.2 重组载体pSTa中Kan基因的检测
3.3.3 减毒E coli O142：ΔSTa的鉴定
3.3.4 减毒E.coli O142：ΔSTa对ZYM-DIEC02细胞的毒性作用
3.3.5 减毒E.coli O142：ΔSTa对乳鼠的毒性
3.4 基于Kil基因的E.coli双向筛选平台的构建及鉴定
3.4.1 噬菌体Kil基因的扩增
3.4.2 CIts857-PRPL启动子序列的扩增
3.4.3 rrnB转录终止子基因的扩增
3.4.4 CIts857-PRPL-Kil-rrnB操纵子的鉴定
3.4.5 假基因yaiT同源臂的扩增
3.4.6 pKil-donor载体的鉴定
3.4.7 双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-Kil)的PCR鉴定
3.4.8 双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-Kil)的验证
3.5 基于mKate2基因的E.coli双向筛选平台的构建及验证
3.5.1 红色荧光蛋白mKate2基因的扩增
3.5.2 CIts857-PRPL-mKate2-rrnB操纵子的鉴定
3.5.3 pmKate2-Donor载体的鉴定
3.5.4 双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-mKate2)的PCR鉴定
3.5.5 双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-mKate2)的验证
3.6 递呈LT192-STa13嵌合蛋白的重组菌株ER-A的构建及鉴定
3.6.1 LT192-STa13嵌合类毒素基因的构建及鉴定
3.6.2 pL-S-Donor载体的鉴定
3.6.3 重组菌株ER-A的PCR鉴定
3.6.4 重组E.coli ER-A中LT192-STa13蛋白的Western blot分析
3.7 递呈LT192-STb嵌合蛋白的重组菌株ER-B的构建及鉴定
3.7.1 LT192-STb嵌合类毒素基因的构建及鉴定
3.7.2 重组打靶载体pL-S-Donor载体的鉴定
3.7.3 重组菌株ER-B的PCR鉴定
3.7.4 重组E.coli ER-B中LT192-STb蛋白的Western blot分析
3.8 E.coli ER-A及ER-B作为口服疫苗递呈抗原载体的可行性评价
3.8.1 ER-A及ER-B对ZYM-DIEC02细胞的毒性
3.8.2 ER-A及ER-B对乳鼠的毒性
3.8.3 ER-A及ER-B对胃液环境的耐受性
3.8.4 ER-A及ER-B对肠液环境耐受性
3.8.5 ER-A及ER-B对胆汁的耐受性
3.8.6 ER-A及ER-B的口服安全性
3.8.7 ER-A及ER-B的生长曲线
3.8.8 ER-A及ER-B的电镜观察
3.8.9 ER-A及ER-B的遗传稳定性
3.8.10 ER-A及ER-B的定植能力
3.9 重组E.coli ER-A及ER-B对小鼠的口服免疫效果测定
3.9.1 免疫小鼠特异性抗体IgG测定
3.9.2 免疫小鼠特异性抗体sIgA测定
3.9.3 淋巴细胞增殖结果
3.9.4 Th1和Th2细胞亚类的检测
3.9.5 体外中和试验
3.9.6 乳鼠体内中和试验
3.9.7 乳鼠攻毒保护试验
3.10 重组菌株对猪的口服免疫效果测定
3.10.1 ER-A及ER-B在猪肠道内的定植能力
3.10.2 免疫猪特异性抗体IgG测定
3.10.3 免疫猪特异性抗体sIgA测定
3.10.4 猪淋巴细胞增殖结果
3.10.5 Th1和Th2细胞亚类的检测
3.10.6 体外中和试验
3.10.7 乳鼠体内中和试验
3.10.8 攻毒保护试验
4 讨论
4.1 猪源肠致病性E.coli流行情况
4.1.1 黏附因子分离率及分布特征
4.1.2 肠毒素和黏附因子之间的关系
4.1.3 肠毒素基因的流行特点
4.1.4 耶尔森毒力岛的流行特点
4.2 E.coli双向筛选平台的构建
4.2.1 同源重组方法的选择
4.2.2 Kil及mKate2操纵子的优势
4.2.3 选择假基因yaiT作为外源序列插入位点的理由
4.3 ER-A及ER-B作为口服疫苗候选菌株的可行性分析
4.3.1 口服疫苗对肠致病性E.coli进行免疫防控的优势
4.3.2 肠致病性E.coli疫苗的设计
4.3.3 用LT192-STa13和LT192-STb嵌合类毒素作为靶抗原的优势
4.3.4 ER-A及ER-B的主要生物学特性
4.4 ER-A和ER-B的免疫效果
4.5 本研究的局限和不足之处
4.6 重组细菌活载体疫苗的发展方向及可能存在的问题
5 结论
致谢
参考文献
攻读博士学位期间发表的学术论文
本文编号：3445925
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