猪流行性腹泻病毒及其N蛋白核仁定位信号对细胞周期的影响

发布时间：2021-10-22 13:31

　　猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）率属于冠状病毒科中的一员，是猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）的病原，以水样腹泻和仔猪高死亡率为主要特征。PEDV N蛋白是目前研究发现在感染细胞中产量最多的蛋白，与病毒的致病性息息相关，因此对PEDV及PEDV N蛋白与细胞相互作用开展研究，有助于了解PEDV的致病机制，并为抗病毒策略提供依据.本研究首先针对PEDV与Vero E6细胞相互作用进行研究。将本实验保存的PEDV感染VeroE6细胞，分别在感染后4h、8h、12h、24h、36h、48h、72h消化处理细胞，借助流式细胞仪检测细胞周期变化。分析结果显示，在Vero E6细胞感染PEDV12h后可观察到细胞在G2/M期停滞的现象。结果表明PEDV可能与VeroE6细胞相互作用来影响细胞在G2/M期的进程。利用含有抑制细胞周期的化学药物诺考达唑（60ng/mL）的培养基培养Vero E6细胞，36h后借助流式细胞仪进行检测，可观察到细胞在G2/M期的停滞现象；利用无血清培养基培养VeroE6细胞... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 PED 概述
        1.1.1 流行病学
        1.1.2 临床症状
        1.1.3 发病机理
        1.1.4 病理变化
        1.1.5 组织嗜性和免疫机制
        1.1.6 免疫防治措施
        1.1.7 诊断
    1.2 PEDV 的生物学特性
        1.2.1 PEDV 病毒粒子的形态结构
        1.2.2 PEDV 理化特性
        1.2.3 PEDV 抗原性
        1.2.4 PEDV 病毒学分类
        1.2.5 PEDV 细胞培养特性
        1.2.6 PEDV 基因组结构
        1.2.7 PEDV 基因组编码蛋白及其功能
            1.2.7.1 非结构蛋白及其功能
            1.2.7.2 结构蛋白及其功能
    1.3 冠状病毒及其蛋白与宿主细胞周期相互作用的研究进展
    1.4 本研究的目的与意义
第二章 感染猪流行性腹泻病毒对 VERO E6 细胞周期的影响
    摘要
    2.1 材料与方法
        2.1.1 病毒与细胞株
        2.1.2 主要试剂和仪器
        2.1.3 PEDV 的培养
        2.1.4 细胞周期的检测
        2.1.5 细胞的化学处理及检测
        2.1.6 病毒 RNA 的提取
        2.1.7 病毒 RNA 的反转录
        2.1.8 病毒载量的检测
        2.1.9 数据的处理和分析
        2.1.10 相对荧光定量对细胞周期因子及相关因子的检测
            2.1.10.1 荧光定量引物的设计
            2.1.10.2 细胞总 RNA 的提取与反转录
            2.1.10.3 常规 PCR 鉴定
            2.1.10.4 PCR 产物的胶回收
            2.1.10.5 纯化产物与载体的连接
            2.1.10.6 连接产物的的转化
            2.1.10.7 重组质粒的提取
            2.1.10.8 荧光定量 PCR 标准品的制备及标准曲线的建立
            2.1.10.9 荧光定量 PCR 细胞培养物样品检测
            2.1.10.11 数据处理与分析
    2.2 结果
        2.2.1 细胞周期的检测
        2.2.2 化学药物处理细胞
        2.2.3 绝对荧光定量 PCR 的方法检测病毒载量的变化
        2.2.4 相对荧光定量 PCR 方法检测细胞周期调控因子的变化
    2.3 讨论
第三章 猪流行性腹泻病毒 N 蛋白核仁定位信号对细胞周期的影响
    摘要
    3.1 材料、仪器和方法
        3.1.1 质粒和细胞
        3.1.2 主要试剂和仪器
        3.1.3 真核表达质粒的构建
            3.1.3.1 目的基因引物的设计
            3.1.3.2 目的基因的扩增
            3.1.3.3 N1 和 N2 基因 PCR 扩增产物的纯化回收
            3.1.3.4 dN 基因的扩增
            3.1.3.5 N 基因和 dN 基因扩增基因产物的纯化回收
            3.1.3.6 N 基因、dN 基因和载体的酶切连接
            3.1.3.7 转化
            3.1.3.8 质粒的提取与鉴定
            3.1.3.9 阳性质粒的大量提取
        3.1.4 重组质粒转染 Vero E6 细胞
        3.1.5 激光共聚焦显微镜分析
        3.1.6 流式细胞仪检测细胞周期的变化
    3.2 结果
        3.2.1 N 基因和 dN 基因的获得
        3.2.2 激光共聚焦显微镜分析重组质粒表达的蛋白在细胞中的定位情况
        3.2.3 细胞流式仪检测转染细胞的周期变化
    3.3 讨论
第四章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 吕茂杰,陈建飞,时洪艳,陈小金,范秀萍,申识川,冯力.  微生物学报. 2011(05)
[2]猪流行性腹泻病毒基因及其疫苗的研究[J]. 王凤,汤德元,李春燕,王彬,张晓杰,甘振磊,刘志杰.  猪业科学. 2010(12)
[3]猪流行性腹泻病毒CH/S株N蛋白基因的遗传变异及其原核表达[J]. 陈建飞,冯力,时洪艳,孙东波,白兴华,佟有恩.  中国预防兽医学报. 2007(11)
[4]SARS冠状病毒核衣壳蛋白抑制胞质分裂和细胞增值[J]. 刘俊丽,冯怡,李楚芳,曹诚,马清钧.  生物技术通讯. 2006(02)
[5]猪病毒性腹泻疾病的预防[J]. 冯力,时洪艳,陈建飞.  养猪. 2005(05)
[6]流行性腹泻病毒M基因与甲病毒载体重组RNA的构建[J]. 余丽芸,侯喜林.  动物医学进展. 2005(05)
[7]猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联弱毒疫苗的研究[J]. 佟有恩,冯力,李伟杰,朱远茂,王明,马思奇.  中国预防兽医学报. 1999(06)
[8]猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联氢氧化铝细胞灭活疫苗的研究[J]. 马思奇,王明,冯力,李伟杰.  中国畜禽传染病. 1995(06)
[9]猪流行性腹泻病毒适应Vero细胞培养及以传代细胞毒制备氢氧化铝灭活疫苗免疫效力试验[J]. 马思奇,王明,周金法,冯力.  中国畜禽传染病. 1994(02)
[10]猪流行性腹泻免疫病理学研究Ⅳ.胃肠道IgA、IgM和IgG产生细胞数及其分泌液和血清中IgA、IgM和IgG含量动态观察[J]. 刘伟杰,张远钰.  兽医大学学报. 1989(03)



本文编号：3451197