PRRSV GP5重组蛋白的构建及其抗血清的制备和中和效果的检测

发布时间：2021-10-22 15:35

　　猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的，主要以母猪发热、厌食、流产、早产及木乃伊胎等，仔猪和生长猪以呼吸系统疾病和高死亡率为特征的接触性传染病。该病传染性强，感染后导致机体的免疫抑制和并发症，病毒基因的变异也给防治增加了难度，给世界养猪业造成了灾难性的损失。糖基化囊膜蛋白5（GP5）是PRRSV的主要结构蛋白之一，具有结合病毒受体及诱导细胞凋亡等功能，该蛋白诱导机体产生的中和抗体具有最强的中和能力，在疫苗制备中意义重大，是研制猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗的优秀候选对象，在研究PRRSV的生理功能及防治过程中也具有重要作用。本研究根据GenBank中收录的PRRSV经典美洲型毒株和中国的高致病性毒株基因序列比对结果，用Primer5.0软件设计特异性引物，利用RT-PCR扩增整个ORF5基因片段，以pMDl8-T为载体对ORF5基因进行克隆。序列测定表明，ORF5基因全长603bp，编码201个氨基酸。根据测序结果设计两对引物（P1/P2，P3/P4），在P1和P4引物中分别设计EcoRⅤ和HindⅢ酶切位点，在P2和P3引物中均设计BamHⅠ酶... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

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符号说明
中文摘要
Abstract
1 引言
    1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述
    1.2 病原学
        1.2.1 PRRSV 分类地位
        1.2.2 PRRSV 形态结构
        1.2.3 PRRSV 的生物学特性
    1.3 流行病学
    1.4 致病机制和临床表现
        1.4.1 致病机制
        1.4.2 临床症状
        1.4.3 剖检病变
    1.5 PRRSV 基因组结构
        1.5.1 PRRSV 非结构蛋白
        1.5.2 PRRSV 结构蛋白
    1.6 PRRSV 免疫学
        1.6.1 体液免疫反应
        1.6.2 细胞免疫反应
    1.7 PRRSV 实验室诊断技术
        1.7.1 病毒分离
        1.7.2 RT-PCR 技术
        1.7.3 免疫胶体金技术（IGSS）
        1.7.4 免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)
        1.7.5 间接免疫荧光 (IFA)
        1.7.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)
    1.8 PRRSV 防制
    1.9 GP5 蛋白研究进展
    1.10 研究目的及意义
    1.11 技术路线
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 病毒
        2.1.2 实验动物
        2.1.3 主要仪器试剂及来源
        2.1.4 主要试剂的配置
            2.1.4.1 EB 溶液的配制
            2.1.4.2 电泳缓冲液
            2.1.4.3 1.0%琼脂糖凝胶的配置
            2.1.4.4 0.05% Tween-20
            2.1.4.5 0.01M 柠檬酸盐缓冲液
            2.1.4.6 LB 液体培养基
            2.1.4.7 Buffer B 溶液
            2.1.4.8 不同浓度一抗、二抗
            2.1.4.9 0.01MPBS(1000ml 配制)
            2.1.4.10 细胞生长液
            2.1.4.11 细胞维持液
            2.1.4.12 细胞消化液
    2.2 试验方法
        2.2.1 细胞的复苏、传代培养及 PRRSV 增殖
            2.2.1.1 Marc-145 细胞的复苏及传代培养
            2.2.1.2 PRRSV 的增殖
        2.2.2 病毒 RNA 的提取
        2.2.3 病毒 RNA 的反转录 PCR
        2.2.4 病毒 ORF5 基因的扩增
        2.2.5 阳性 PCR 产物的纯化回收
        2.2.6 PCR 产物与载体连接
        2.2.7 感受态的制备
        2.2.8 转化感受态细胞
        2.2.9 阳性质粒的提取
        2.2.10 重组质粒的的构建和鉴定
            2.2.10.1 引物设计
            2.2.10.2 重组质粒 pET-GP5a 质粒的构建
            2.2.10.3 重组质粒 pET-GP5 质粒的构建
        2.2.11 重组质粒的诱导表达
            2.2.11.1 阳性重组质粒转化表达感受态
            2.2.11.2 重组质粒的诱导表达
            2.2.11.3 SDS-PAGE 蛋白质电泳
            2.2.11.4 重组蛋白的纯化
            2.2.11.5 重组蛋白的 Western blot 检测
        2.2.12 重组蛋白抗血清的制备
            2.2.12.1 免疫程序
            2.2.12.2 ELISA 检测
            2.2.12.3 抗血清的制备与纯化
        2.2.13 重组蛋白抗血清中和效果的检测
            2.2.13.1 抗血清中和效果的 ELISA 检测
            2.2.13.2 抗血清病毒阻断实验
3 结果与分析
    3.1 ORF5 全基因克隆
    3.2 GP5 重组基因表达载体的构建
    3.3 蛋白的诱导表达与纯化
    3.4 蛋白的 Western-blot 检测
    3.5 重组蛋白抗血清的制备结果
    3.6 抗血清中和效果的检验结果
        3.6.1 ELISA 检测结果
        3.6.2 抗血清病毒阻断实验结果
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
硕士期间发表的论文
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]截短的猪繁殖与呼吸综合征ORF5基因及重组蛋白的原核表达[J]. 李国娟,柳纪省,李宝玉,娄忠子,田永强.  生物技术通报. 2010(03)
[2]猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达[J]. 尹国友,孙婕,黄保续.  动物医学进展. 2009(12)
[3]高致病性蓝耳病流行的病因分析与防制[J]. 王五州,王建辉.  畜禽业. 2007(10)
[4]高致病性猪蓝耳病的综合防治[J]. 刘国信.  北京农业. 2007(22)
[5]猪免疫抑制性疾病的流行特点与控制对策[J]. 杨汉春.  中国畜牧兽医. 2004(05)
[6]猪繁殖与呼吸综合征病毒的持续感染[J]. 刘光清,仇华吉,蔡雪晖,童光志.  中国预防兽医学报. 2002(04)
[7]猪繁殖与呼吸综合征病毒形态学特征[J]. 李成,李六金,谷守林,蔡虹,姜焕宏,赵世君,张海,李秦.  畜牧兽医学报. 2001(06)
[8]猪生殖与呼吸综合征病理损害与免疫抑制观察[J]. 马德慧,马国文,丁英,姚春雨.  中国兽医科技. 2001(06)
[9]猪繁殖与呼吸综合征研究进展[J]. 谢英,单天锡.  中国兽医杂志. 2001(01)
[10]猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染的免疫学研究进展[J]. 李华,杨汉春,郭玉璞.  中国兽医杂志. 1999(09)



本文编号：3451389