鸡Sox2多克隆抗体的制备及其初步应用

发布时间：2021-10-23 09:41

　　Sox2基因作为维持胚胎干细胞自我更新与全能性的关键基因,最近几年其一直是干细胞研究的热点。本研究旨在克隆鸡Sox2基因,利用原核表达技术获得纯化的His-Sox2融合蛋白,以此为抗原制备鸡Sox2多克隆抗体并检测其特异性和有效性。从20日龄鸡的睾丸组织中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增Sox2基因编码序列,并将其克隆到pMD18-T载体。对确定的阳性质粒进行生物信息学分析,限制性酶切获得的Sox2片段亚克隆到pET30-a表达载体,构建原核表达载体pET30a-Sox2。该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白表达,用SDS-PAGE电泳及Western blotting检测融合蛋白表达。优化表达条件,大量增菌,1.0mmol/L IPTG37℃诱导4h,以Ni-NTA argrose介质在变性条件下分离纯化His-Sox2融合蛋白。纯化的融合蛋白间隔2周,分4次皮下多点注射新西兰大白兔。最后一次注射后7d,采血分离血清,并以此为第一抗体,分别以纯化的His-Sox2融合蛋白和来自小鸡睾丸组织的蛋白样品作为抗原,借助于Wes... 

【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词符号说明
文献综述
    第一章 Sox2基因的研究进展
        1.1 Sox基因的简介
        1.2 Sox2基因的结构特征
        1.3 Sox2基因的主要功能
        1.4 Sox2基因与干细胞
            1.4.1 Sox2基因与ESCs
            1.4.2 Sox2基因与iPS细胞
        1.5 生物信息学应用
        1.6 免疫组化概述
            1.6.1 免疫组织化学的应用
        1.7 研究目的与意义
        1.8 实验路线
试验研究
    第二章 鸡Sox2基因的克隆和生物信息学分析
        2.1 引言
        2.2 材料与方法
            2.2.1 动物来源
            2.2.2 主要试剂
            2.2.3 菌株
            2.2.4 仪器设备
            2.2.5 常用溶液
            2.2.6 Sox2基因的克隆
        2.3 结果与分析
            2.3.1 RT-PCR
            2.3.2 重组质粒的酶切鉴定
            2.3.3 测序结果
            2.3.4 核苷酸序列同源性分析
            2.3.5 氨基酸序列同源性分析
            2.3.6 氨基酸序列系统进化树分析
            2.3.7 Sox2编码蛋白质信号肽预测
            2.3.8 Sox2基因的密码子偏好性推测
            2.3.9 Sox2蛋白的磷酸化位点和糖基化位点分析
            2.3.10 Sox2蛋白疏水性、亲水性及跨膜结构域分析
            2.3.11 抗原位点
            2.3.12 鸡Sox2蛋白的结构分析
            2.3.13 Sox2蛋白质结构分析
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第三章 鸡Sox2基因的原核表达与多克隆抗体制备
        3.1 引言
        3.2 材料与方法
            3.2.1 动物来源
            3.2.2 主要试剂
            3.2.3 仪器设备
            3.2.4 菌株和质粒
            3.2.5 pET30a-Sox2原核表达载体构建
            3.2.6 pET30a-Sox2在大肠杆菌中的诱导表达
            3.2.7 融合蛋白His-Sox2的纯化
            3.2.8 制备兔抗Sox2多克隆抗体
            3.2.9 免疫组织化学检测
        3.3 结果与分析
            3.3.1 原核表达与蛋白纯化
            3.3.2 融合蛋白Western blotting鉴定
            3.3.3 多克隆抗体特异性检测
            3.3.4 Western blottin检测
        3.4 讨论
        3.5 小结
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况


【参考文献】：
期刊论文
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[3]小鼠sox2基因的克隆及其原核表达载体构建[J]. 王春红,周秀梅,刘辉,黎江,钱其军.  浙江理工大学学报. 2010(02)
[4]Nanog与肿瘤细胞和干细胞的关系[J]. 李冬雪,牛朝诗.  国际病理科学与临床杂志. 2010(01)
[5]山羊Sox2基因克隆、原核表达和GST融合蛋白纯化[J]. 郑喜邦,杨照海,刘平,赵华,卢晟盛,卢克焕,毕方方.  畜牧兽医学报. 2009(10)
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[7]间接酶免疫组化检测DPV在感染鸭体内细胞定位的研究和应用[J]. 徐超,程安春,汪铭书,文明,刘菲,韩小英,宋涌,廖永洪,陈孝跃.  中国兽医学报. 2007(05)
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[10]免疫组化检测鸭疫里默氏杆菌（RA）方法的建立[J]. 孟琼华,程安春.  畜禽业. 2006(10)



本文编号：3452959