皮特兰与清平猪PAM细胞感染PRRSV前后miRNA表达谱分析

发布时间：2021-10-24 18:37

　　猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种病毒性传染病,给养猪业带来了巨大的危害和经济损失。PRRSV是一种对肺泡巨噬细胞（PAM）具有强亲嗜性的单股正链RNA病毒。首株PRRSV就是从PAM上分离获得的。PAM被认为是急性感染期病毒复制的主要位点,也是肺部最早接触病原微生物的免疫防御细胞之一。miRNA是转录后起调控作用的一类内源性非编码小RNA,通过与靶基因的3’-UTR结合,抑制靶基因的翻译或者导致其降解,从而实现对靶基因的调控作用。越来越多的研究表明miRNA在免疫细胞的发育、分化、非特异性免疫、特异性免疫应答及疾病发展中都发挥着重要的调节作用。本研究以皮特兰和清平猪PAM感染PRRSV后的早、中、晚三个时期（9h、36h、60h）为研究对象,并以同时间点未感染PRRSV的PAM为对照,构建了12个miRNA文库。利用Solexa高通量测序技术对12个miRNA文库进行了测序分析,并通过实验对测序结果进行验证,取得了如下结果：（1）在皮特兰和清平猪PAM中分别获得97,729,281和83,323,798条原始小RNA序列。通过去除接头、污染... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：99 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 猪繁殖与呼吸综合征
    2 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学特征
    3 猪肺泡巨噬细胞(PAM)
    4 miRNA功能和研究进展
        4.1 miRNA的生物合成过程
        4.2 miRNA的作用机制
        4.3 miRNA的研究方法
        4.4 miRNA在免疫应答和抗病毒方面的功能研究
            4.4.1 miRNA在免疫应答中的作用
            4.4.2 miRNA在病毒感染中的作用
    5 研究目的和意义
第二章 材料和方法
    1 试验材料
        1.1 细胞、毒株
        1.2 载体和菌株
        1.3 试验主要仪器和设备
        1.4 试验主要药品和试剂
        1.5 试验缓冲液和常用试剂的配制
        1.6 主要数据库和软件
    2 试验方法
        2.1 仔猪的选择及抗体的检测
        2.2 PAM的分离及病毒检测
            2.2.1 PAM的分离
            2.2.2 细胞液RNA的提取
            2.2.3 RNA浓度测定和质量检测
            2.2.4 cDNA的合成
            2.2.5 PRRSV抗原检测
        2.3 细胞的培养
        2.4 PRRSV的增殖
        2.5 PRRSV半数细胞培养物感染量(TCID50)的测定
        2.6 不同猪种PRRSV易感性实验
            2.6.1 PAM细胞的收集
            2.6.2 绝对荧光定量PCR绘制不同猪种病毒复制曲线
        2.7 高通量测序样品的准备
            2.7.1 PAM的培养和处理
            2.7.2 细胞总RNA的提取
            2.7.3 RNA浓度测定和质量检测
        2.8 Solexa上样测序、数据的产生及生物信息学数据分析
            2.8.1 生物信息学分析流程
            2.8.2 基本生物信息学分析
            2.8.3 高级生物信息学分析
        2.9 候选miRNAs的验证
            2.9.1 总RNA去除基因组污染
            2.9.2 茎环引物反转录cDNA第一链的合成
            2.9.3 cDNA检测
            2.9.4 miRNAs成熟序列的扩增引物及茎环反转录特异引物的设计
            2.9.5 miRNAs成熟序列的扩增
            2.9.6 miRNAs成熟序列的克隆鉴定
            2.9.7 实时定量法对miRNAs的验证
        2.10 半定量法检测miRNA组织表达谱
            2.10.1 大白猪各组织样总RNA的提取
            2.10.2 cDNA的合成
            2.10.3 miRNA组织表达谱分析
        2.11 miR-210靶基因验证
            2.11.1 靶基因MX13'UTR的扩增
            2.11.2 pMD18-T片段质粒的双酶切及缺失片段的回收
            2.11.3 pmirGLO载体的构建
            2.11.4 pmirGLO质粒的中量提取
            2.11.5 细胞转染
            2.11.6 双荧光素酶报告基因的检测
第三章 结果与分析
    1 PAM细胞PRRSV检测
    2 不同猪种PRRSV易感性试验
        2.2 QORF7重组质粒标准曲线的绘制
        2.3 不同品种猪PRRSV动力复制曲线
    3 测序样品RNA质量分析
    4 Solexa文库测序及生物信息学分析
        4.1 皮特兰测序结果分析
            4.1.1 Solexa文库概述
            4.1.2 Small RNA长度分布
            4.1.3 小RNA分类注释
            4.1.4 miRNAs的碱基分布特征
            4.1.5 已知miRNA分析
            4.1.6 候选miRNA预测
            4.1.7 已知miRNA差异分析
            4.1.8 miRNA靶基因位点预测
            4.1.9 靶基因的功能注释
        4.2 清平测序结果分析
            4.2.1 Solexa文库概述
            4.2.2 Small RNA长度分布
            4.2.3 小RNA分类注释
            4.2.4 小RNA与重复序列比对结果
            4.2.5 已知miRNA分析
            4.2.6 已知miRNA“种子”区序列碱基编辑
            4.2.7 候选miRNA预测
            4.2.8 已知miRNA差异表达分析
    5 miRNAs实时荧光定量PCR分析验证
        5.1 RNA的提取
        5.2 cDNA检测结果
        5.3 miRNAs成熟序列的扩增
        5.4 miRNAs的实时定量PCR结果
    6 miRNAs在猪中不同组织中的表达结果
    7 MX1双荧光素酶报告基因载体的构建结果
        7.1 MX1 3'UTR序列的扩增
        7.2 pmirGLO MX1 3'UTR重组质粒的鉴定
        7.3 双荧光素酶报告基因的检测结果
第四章 讨论
    1 试验样品的选择
    2 检测方法和测序质量
    3 miRNA靶基因预测
    4 miRNA表达分析
        4.1 实时荧光定量PCR检测miRNA
        4.2 差异miRNA实时定量验证
第五章 小结
    5.1 主要结论
    5.2 下一步工作
参考文献
致谢
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]miRNA-124靶标功能的生物信息学挖掘[J]. 魏强,李广林,郭韬.  生命科学研究. 2010(05)
[2]猪无名高热综合症[J]. 万遂如.  养殖与饲料. 2006(10)
[3]猪繁殖与呼吸综合征及其在我国的现状与对策[J]. 蔡雪晖,柴文君,翁长江,刘光清,郭宝清.  中国预防兽医学报. 2000(S1)
[4]MxA抗病毒蛋白的研究进展[J]. 杨吉成.  苏州医学院学报. 2000(06)
[5]从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J]. 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙.  中国畜禽传染病. 1996(02)



本文编号：3455779