猪流感病毒NS1蛋白关键氨基酸位点对细胞定位及细胞因子表达的影响

发布时间：2021-10-27 14:56

　　猪流感（swine influenza, SI）是由猪流感病毒（swine influenza virus, SIV）引起的一种急性、传染性和群发性呼吸道疾病。NS1（non-structural1）蛋白是病毒重要的调控蛋白,是病毒感染期间重要的毒力因子,通过多种机制抵抗宿主抗病毒应答。对NS1蛋白的研究发现,NS1蛋白影响宿主免疫系统的功能,与NS1蛋白上的特定氨基酸位点密切相关。本研究拟对NS1关键氨基酸位点进行突变,分析表达蛋白对细胞内干扰素（IFN-α/β）和肿瘤坏死因子（TNF-a）的影响,进一步明确NS1抑制干扰素产生机理,为防治猪流感提供理论依据。研究扩增了猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/2007（H1N2）分离株NS1基因,克隆到pCAGGS表达载体,构建重组表达载体pCAGGS-NS1,经PCR和酶切鉴定,获得阳性克隆,序列分析表明NS1基因序列正确,无突变。设计引物,分别对42、92、42/92位氨基酸进行突变,构建了pCAGGS-NS1S42P, pCAGGS-NS1D92E pCAGGS-NS1S42P/D92E重组表达载体。提取pCAGGS-N... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一篇 文献综述
    第一章 猪流感病毒NS1蛋白的研究进展
        1 猪流感概述
        2 猪流感病毒编码的蛋白特性
        3 NS1蛋白结构和功能
            3.1 NS1蛋白的结构特征
            3.2 NS1蛋白的功能
                3.2.1 NS1蛋白抑制宿主细胞蛋白的合成
                3.2.2 NS1蛋白促进病毒蛋白的合成与表达
                3.2.3 NS1蛋白颉颃干扰素及肿瘤坏死因子
                3.2.4 NS1蛋白影响宿主细胞凋亡
            3.3 NS1蛋白对流感病毒致病性和毒力的影响
                3.3.2 NS1蛋白与病毒致病性
                3.3.3 NS1蛋白与病毒毒力
        4 NS1蛋白的应用
            4.1 NS1蛋白在鉴别诊断中的应用
            4.2 NS1蛋白作为抗病毒治疗的靶点
            4.3 NS1基因突变重组病毒对肿瘤的治疗
            4.4 针对NS1蛋白设计新型疫苗
    参考文献
第二篇 试验研究
    第二章 猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/2007株NS1蛋白关键氨基酸位点对细胞定位的影响
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 NS1及其突变体真核表达载体的构建
                    1.2.1.1 引物设计
                    1.2.1.2 目的基因扩增与回收
                    1.2.1.3 真核重组质粒的构建
                    1.2.1.4 重组质粒的制备、鉴定及定量
                1.2.2 脂质体Lipofectamine~(TM) 2000介导瞬时转染细胞
                1.2.3 Westen blot鉴定NS1重组蛋白的表达
                1.2.4 间接免疫荧光技术分析NS1及其突变体蛋白的细胞定位
                1.2.5 免疫沉淀分析NS1蛋白和NP蛋白相互作用
        2 结果
            2.1 NS1及其突变体真核表达载体的构建
            2.2 Westen blot检测NS1及NS1突变体蛋白
            2.3 NS1及NS1突变体蛋白在真核细胞中的定位分析
            2.4 免疫沉淀分析NS1蛋白和NP蛋白相互作用
        3 讨论
        参考文献
        Abstract
    第三章 猪流感病毒NS1蛋白关键氨基酸位点对细胞因子影响
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 脂质体Lipofectamine~(TM)2000介导瞬时转染细胞
                1.2.2 IFN-α/β和TNF-α分析
                    1.2.2.1 提取细胞总RNA
                    1.2.2.2 RT-PCR扩增IFN-α/β和TNF-α基因
                    1.2.2.3 ELISA检测IFN-α/β和TNF-α蛋白表达水平
        2 结果
            2.1 IFN-α/βmRNA和TNF-αmRNA转录水平
            2.2 IFN-α/β和TNF-α ELISA检测
        3 讨论
        参考文献
        Abstract
    第四章 不同毒株NS1蛋白对细胞IFN-α/β和TNF-α表达的影响
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 病毒、细胞及实验小鼠
                1.1.2 主要试剂和仪器
            1.2 方法
                1.2.1 ELISA试剂盒检测IFN-α/β和TNF-α蛋白
                1.2.2 BALB/c小鼠免疫及分组
                1.2.3 小鼠淋巴细胞分离
                1.2.4 流式细胞仪测定T细胞亚群
        2 结果
            2.1 IFN-α/β和TNF-α ELISA检测结果
            2.2 流式细胞仪测定T细胞亚群
        3 讨论
        参考文献
        Abstract
全文总结
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]异型流感病毒感染小鼠肺细胞因子水平变化[J]. 郭志华,牛术孟,金红.  微生物学杂志. 2011(04)
[2]RT-PCR技术检测猪流感病毒[J]. 吕翠,马小明,尹燕博,温建新,单虎.  中国农学通报. 2008(10)
[3]H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析[J]. 王方昆,袁秀芳,王一成,张存,徐丽华,刘思当.  中国农业科学. 2008(02)
[4]禽流感病毒NS第263277位核苷酸缺失降低其抗干扰素能力[J]. 龙进学,王曲直,刘秀梵.  微生物学通报. 2006(02)
[5]H5N1亚型禽流感病毒NS第263277位核苷酸缺失提高病毒对鸡的致病力[J]. 龙进学,薛峰,彭宜,顾敏,刘秀梵.  微生物学报. 2006(02)
[6]A型流感病毒NS1蛋白的结构与功能[J]. 魏宏,林锋强,庄向生,张步伍.  动物医学进展. 2005(09)
[7]应用定点突变技术进行流感病毒NS1蛋白功能的研究[J]. 李先茜,杜培革,傅桂莲,董婕,齐立.  北华大学学报(自然科学版). 2004(04)

博士论文
[1]我国部分地区猪流感病毒分子流行病学及致病性研究[D]. 祁贤.南京农业大学 2006



本文编号：3461832