口蹄疫O型病毒3A和3B基因对病毒宿主嗜性的影响

发布时间：2021-10-28 14:21

　　口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）非结构蛋白3A基因的突变（点突变或缺失）和3B基因的拷贝数与病毒的宿主嗜性有关,但FMDV宿主偏嗜性的分子机制目前还不明了。本研究选取口蹄疫Mya-98谱系牛源分离株O/GZSB/2011和猪源分离株O/GD/2/CHN/2010,进行了全基因组测序和全长感染性cDNA克隆的构建,并在此基础上构建了3A缺失突变体（rvSBA93-102、rvSBΔ133-143、rvGDA93-102和rvGDA133-143）3A嵌合病毒（rvSB70、rvOZ70和rvSBqO）、3A标记病毒（rvSBm、rvSBh和vSBf）和3B突变体病毒（rvB1323、rv2B3、rvB13和rv1B3）,分析了这些重组病毒在不同宿主细胞上的生物学特性,结果表明：1、4株3A缺失突变体在BHK-21、PK-15和胎猪肾原代细胞（FPK）上具有与亲本毒株相似的蚀斑表型和生长动力学；在胎牛肾原代细胞（FBK）上,rvSBA133-143和rvGDA133-143具有与其亲本毒株相似的蚀斑表型和生长动力学,而rvSBA93-102和... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：130 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 口蹄疫病毒
    1.2 FMD的历史与分布
    1.3 FMD在我国的流行现状
        1.3.1 A型
        1.3.2 Asia 1型
        1.3.3 O型
    1.4 FMDV基因组结构及其功能
        1.4.1 FMDV非编码区的功能
        1.4.2 FMDV结构蛋白的功能
        1.4.3 FMDV非结构蛋白的功能
    1.5 反向遗传学技术及其在RNA病毒中的应用
        1.5.1 反向遗传学技术
        1.5.2 反向遗传学技术在RNA病毒中的应用
        1.5.3 RNA病毒反向遗传学技术的不足
    1.6 3A与FMDV的宿主嗜性
    1.7 研究内容和方法
第二章 两株不同来源的口蹄疫病毒的全基因组序列测定及其基因特征分析
    2.1 材料
        2.1.1 病毒样品
        2.1.2 FMDV参考毒株
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 仪器设备
        2.1.5 引物的设计与合成
    2.2 方法
        2.2.1 病毒RNA的提取
        2.2.2 反转录
        2.2.3 FMDV基因组全长扩增
        2.2.4 PCR产物的纯化回收及序列测定
        2.2.5 序列分析
    2.3 结果
        2.3.1 RT-PCR
        2.3.2 全基因组序列分析
        2.3.3 序列比对分析
        2.3.4 系统发生树分析
    2.4 讨论
第三章 两株口蹄疫病毒全长感染性cDNA克隆的构建
    3.1 材料
        3.1.1 病毒、质粒、细胞
        3.1.2 试剂
        3.1.3 实验动物
        3.1.4 仪器设备
    3.2 方法
        3.2.1 引物设计
        3.2.2 全长cDNA克隆的构建
        3.2.3 分子标签的引入
        3.2.4 转染
        3.2.5 重组病毒的RT-PCR鉴定及稳定性分析
        3.2.6 间接免疫荧光检测
        3.2.7 生长曲线分析
        3.2.8 蚀斑形态分析
        3.2.9 乳鼠毒价的测定
    3.3 结果
        3.3.1 FMDV全基因组序列的RT-PCR扩增
        3.3.2 融合PCR扩增
        3.3.3 重组质粒的酶切鉴定
        3.3.4 分子标签的引入
        3.3.5 重组质粒的序列测定
        3.3.6 重组病毒的拯救
        3.3.7 重组病毒的RT-PCR检测
        3.3.8 重组病毒的遗传稳定性分析
        3.3.9 间接免疫荧光检测
        3.3.10 生长曲线分析
        3.3.11 蚀斑表型分析
        3.3.12 乳鼠致病力分析
    3.4 讨论
第四章 FMDV 3A缺失突变体的构建及其生物学特性研究
    4.1 材料
        4.1.1 细胞和质粒
        4.1.2 试剂
        4.1.3 仪器设备
    4.2 方法
        4.2.1 引物设计
        4.2.2 PCR扩增
        4.2.3 PCR产物的纯化
        4.2.4 融合PCR
        4.2.5 含3A缺失的FMDV全长cDNA的构建
        4.2.6 转染
        4.2.7 3A缺失突变体的RT-PCR鉴定及稳定性分析
        4.2.8 间接免疫荧光检测
        4.2.9 生长曲线分析
        4.2.10 3A缺失突变体在不同细胞上的复制能力和蚀斑表型分析
        4.2.11 荧光定量RT-PCR
        4.2.12 乳鼠致病性试验
    4.3 结果
        4.3.1 PCR扩增结果
        4.3.2 融合PCR扩增
        4.3.3 含3A缺失的FMDV全长cDNA的鉴定
        4.3.4 3A缺失病毒的拯救
        4.3.5 3A缺失病毒的RT-PCR检测
        4.3.6 3A缺失病毒的遗传稳定性分析
        4.3.7 间接免疫荧光检测
        4.3.8 生长曲线分析
        4.3.9 蚀斑表型分析
        4.3.10 荧光定量RT-PCR分析
    4.4 讨论
第五章 嵌合FMDV的构建及其生物学特征
    5.1 材料
        5.1.1 细胞和质粒
        5.1.2 试剂
        5.1.3 仪器设备
    5.2 方法
        5.2.1 引物设计
        5.2.2 PCR扩增
        5.2.3 PCR产物的纯化
        5.2.4 融合PCR
        5.2.5 嵌合FMDV全长cDNA的构建
        5.2.6 转染
        5.2.7 嵌合的RT-PCR鉴定及稳定性分析
        5.2.8 间接免疫荧光检测
        5.2.9 生长曲线分析
        5.2.10 嵌合在不同细胞上的复制能力和蚀斑表型分析
        5.2.11 荧光定量RT-PCR
    5.3 结果
        5.3.1 PCR扩增结果
        5.3.2 融合PCR扩增
        5.3.3 嵌合FMDV全长cDNA的鉴定
        5.3.4 嵌合病毒的拯救
        5.3.5 嵌合病毒的RT-PCR检测
        5.3.6 嵌合病毒的遗传稳定性分析
        5.3.7 间接免疫荧光检测
        5.3.8 生长曲线分析
        5.3.9 蚀斑表型分析
        5.3.10 荧光定量RT-PCR分析
    5.4 讨论
第六章 3A标记的FMDV的构建及其生物学特性分析
    6.1 材料
        6.1.1 细胞和质粒
        6.1.2 试剂
        6.1.3 仪器设备
    6.2 方法
        6.2.1 引物设计
        6.2.2 PCR扩增
        6.2.3 PCR产物的纯化
        6.2.4 融合PCR
        6.2.5 3A标记的FMDV全长cDNA的构建
        6.2.6 转染
        6.2.7 3A标记病毒的RT-PCR鉴定及稳定性分析
        6.2.8 间接免疫荧光检测
        6.2.9 Western blot检测
        6.2.10 生长曲线分析
        6.2.11 3A标记病毒在不同细胞上的复制能力和蚀斑表型分析
    6.3 结果
        6.3.1 PCR扩增结果
        6.3.2 融合PCR扩增
        6.3.3 3A标记的FMDV全长cDNA的鉴定
        6.3.4 3A标记病毒的拯救
        6.3.5 3A标记病毒的RT-PCR检测
        6.3.6 3A缺失病毒的遗传稳定性分析
        6.3.7 间接免疫荧光检测
        6.3.8 Western blot分析
        6.3.9 生长曲线分析
        6.3.10 蚀斑表型分析
    6.4 讨论
第七章 FMDV 3B突变株的构建及其生物学特性分析
    7.1 材料
        7.1.1 细胞和质粒
        7.1.2试剂
        7.1.3 仪器设备
    7.2 方法
        7.2.1 引物设计
        7.2.2 PCR扩增
        7.2.3 PCR产物的纯化
        7.2.4 融合PCR
        7.2.5 PCR扩增
        7.2.6 融合PCR
        7.2.7 3B突变体FMDV全长cDNA的构建
        7.2.8 转染
        7.2.9 3B突变体病毒的RT-PCR鉴定及稳定性分析
        7.2.10 间接免疫荧光检测
        7.2.11 Western blot检测
        7.2.12 生长曲线分析
        7.2.13 3B突变体病毒在不同细胞上的复制能力和蚀斑表型分析
    7.3 结果
        7.3.1 PCR扩增结果
        7.3.2 融合PCR扩增
        7.3.3 3B突变体FMDV全长cDNA的鉴定
        7.3.4 3B突变体病毒的拯救
        7.3.5 3B突变体病毒的RT-PCR检测
        7.3.6 3B突变体病毒的遗传稳定性分析
        7.3.7 间接免疫荧光检测
        7.3.8 Western blot分析
        7.3.9 生长曲线分析
        7.3.10 蚀斑表型分析
    7.4 讨论
第八章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]RDD基序对口蹄疫Asia1型毒株感染力的影响[J]. 郑海学,郭建宏,靳野,尚佑军,田宏,杨亚民,刘湘涛,才学鹏.  科学通报. 2010(14)
[2]牛Asia 1型口蹄疫病毒感染性克隆的构建[J]. 李爽,张润祥,宋鸽,高明春,刘湘涛,王君伟.  生物工程学报. 2009(11)
[3]RNA病毒作为疫苗载体的研究与应用[J]. 胡伟,段海清,陈惠鹏.  生物技术通讯. 2007(03)



本文编号：3462933