牛支原体08M株突变体文库的构建及鉴定
发布时间：2021-10-29 11:58
旨在使用转座子插入突变方法构建牛支原体08M株的突变体文库,为毒力相关基因的鉴定提供技术平台。测定了牛支原体08M株的浓度（颜色变化单位,CCU）和庆大霉素最低抑菌浓度（MIC）。应用电穿孔方法,将庆大霉素抗性质粒p ISM2062（携带有转座子Tn4001mod）导入牛支原体08M株感受态细胞内,经抗性平板筛选、液体培养及PCR鉴定,构建08M株的突变体文库。随机挑选10个克隆菌株传10代检测转座子稳定性,挑选2个克隆用Southern blot检测转座子是否存在多次插入。结果显示:08M株浓度为1.13×107CCU/m L,庆大霉素MIC为16 ng/μL;电转化p ISM2062的牛支原体08M株在抗性平板形成菌落445个,从中克隆培养成功380个,PCR鉴定结果显示存在Tn插入的菌株有263个,阳性率为69.21%（263/380）;插入的转座子稳定传代,且无多次插入。本研究成功初步构建了牛支原体08M株的转座子插入突变体文库。
【文章来源】：畜牧与兽医. 2018,50(05)北大核心
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
抗性平板上生长的菌落(100×)
裕?∮?0μg/mL的Gm作抗性筛选用。2.2电转化试验观察37℃5%CO2培养箱中培养10d的平板上菌落生长情况。结果显示，试验组有菌落生长，但有的菌落生长不佳(图1)。抗性平板上的对照组没有菌落生长，将对照组涂布在无抗性平板上的菌落进行计数，结果为1.46×108cfu/mL。使用一次性灭菌巴氏吸管共挑取试验组菌落445个，置于液体培养基培养，结果380个菌落生长，对生长菌落甘油保菌进行后续测定。2.3PCＲ鉴定结果显示，阳性转化样品及质粒对照能够扩增到400bp特异性目的片段，野生型08M菌株PCＲ无目的片段(图2)。共检测得到263个阳性克隆，阳性率为69.21%(263/380)，根据对照组菌液涂无抗性平板后的菌落计数结果，计算出转化效率为1.8×10－6(263/1.46×108)。图1抗性平板上生长的菌落(100×)M．DNA分子量标准;1－17.突变体样品依次为A304、A305、A307、A310～A323;18.pISM2062质粒;19.08MDNA;20.ddH2O图2牛支原体08M株转化子DNA的PCＲ分析2.4稳定性检测挑取的阳性突变体连续传10代后，PCＲ扩增仍可检测到400bp特异性目的片段，表明转座子可稳定存在于突变株中(图3)。M．DNA分子量标准;1－10.转化株样品(A027、A042、A044、A057、A060、A067、A076、A085、A347、A405);11.pISM2062质粒;12.08MDNA;13.ddH2O图3转化株传10代的PCＲ测定结果2.5转化株Southernblot测定如图4显示，挑选的A347和A405转化株在传5代和10代后，未检测到多次插入，表明转座子稳定存在于转化株基因组中。2个杂交条带分子量均在7500bp左右。M．DNA分子量标准;1，A347(5代);2.A405(5代);3.A347(10代);4.A405(10代);5.08M野生型图4转化株Southernblot结果3讨论牛支原体是引起肉牛和奶牛发病的一种重要病原·28·AnimalH
剐云桨迳仙?さ木??100×)M．DNA分子量标准;1－17.突变体样品依次为A304、A305、A307、A310～A323;18.pISM2062质粒;19.08MDNA;20.ddH2O图2牛支原体08M株转化子DNA的PCＲ分析2.4稳定性检测挑取的阳性突变体连续传10代后，PCＲ扩增仍可检测到400bp特异性目的片段，表明转座子可稳定存在于突变株中(图3)。M．DNA分子量标准;1－10.转化株样品(A027、A042、A044、A057、A060、A067、A076、A085、A347、A405);11.pISM2062质粒;12.08MDNA;13.ddH2O图3转化株传10代的PCＲ测定结果2.5转化株Southernblot测定如图4显示，挑选的A347和A405转化株在传5代和10代后，未检测到多次插入，表明转座子稳定存在于转化株基因组中。2个杂交条带分子量均在7500bp左右。M．DNA分子量标准;1，A347(5代);2.A405(5代);3.A347(10代);4.A405(10代);5.08M野生型图4转化株Southernblot结果3讨论牛支原体是引起肉牛和奶牛发病的一种重要病原·28·AnimalHusbandry＆VeterinaryMedicine2018Vol.50No.5
【参考文献】：
期刊论文
[1]牛支原体逃避宿主免疫的研究进展[J]. 季文恒,储岳峰,赵萍,陈胜利,郝华芳,王展慧,刘永生. 畜牧兽医学报. 2017(03)
[2]4种抗原定量方法观察牛支原体培养特征[J]. 王展慧,赵萍,陈胜利,郝华芳,秦明明,王绍伟,刘永生,储岳峰. 中国畜牧兽医. 2016(10)
[3]肉牛传染性牛支原体肺炎流行的诊断[J]. 石磊,龚瑞,尹争艳,周勇,裴洁,胡智斌,王利霞,胡长敏,刘涛,陈颖钰,廖娟红,赵俊龙,陈焕春,郭爱珍. 华中农业大学学报. 2008(05)
[4]国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体[J]. 辛九庆,李媛,郭丹,宋念华,胡守萍,陈超,裴洁,曹培丽. 中国预防兽医学报. 2008(09)
博士论文
[1]牛支原体表达载体的构建[D]. 李佳禾.中国农业大学 2015
本文编号：3464612
【文章来源】：畜牧与兽医. 2018,50(05)北大核心
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
抗性平板上生长的菌落(100×)
裕?∮?0μg/mL的Gm作抗性筛选用。2.2电转化试验观察37℃5%CO2培养箱中培养10d的平板上菌落生长情况。结果显示，试验组有菌落生长，但有的菌落生长不佳(图1)。抗性平板上的对照组没有菌落生长，将对照组涂布在无抗性平板上的菌落进行计数，结果为1.46×108cfu/mL。使用一次性灭菌巴氏吸管共挑取试验组菌落445个，置于液体培养基培养，结果380个菌落生长，对生长菌落甘油保菌进行后续测定。2.3PCＲ鉴定结果显示，阳性转化样品及质粒对照能够扩增到400bp特异性目的片段，野生型08M菌株PCＲ无目的片段(图2)。共检测得到263个阳性克隆，阳性率为69.21%(263/380)，根据对照组菌液涂无抗性平板后的菌落计数结果，计算出转化效率为1.8×10－6(263/1.46×108)。图1抗性平板上生长的菌落(100×)M．DNA分子量标准;1－17.突变体样品依次为A304、A305、A307、A310～A323;18.pISM2062质粒;19.08MDNA;20.ddH2O图2牛支原体08M株转化子DNA的PCＲ分析2.4稳定性检测挑取的阳性突变体连续传10代后，PCＲ扩增仍可检测到400bp特异性目的片段，表明转座子可稳定存在于突变株中(图3)。M．DNA分子量标准;1－10.转化株样品(A027、A042、A044、A057、A060、A067、A076、A085、A347、A405);11.pISM2062质粒;12.08MDNA;13.ddH2O图3转化株传10代的PCＲ测定结果2.5转化株Southernblot测定如图4显示，挑选的A347和A405转化株在传5代和10代后，未检测到多次插入，表明转座子稳定存在于转化株基因组中。2个杂交条带分子量均在7500bp左右。M．DNA分子量标准;1，A347(5代);2.A405(5代);3.A347(10代);4.A405(10代);5.08M野生型图4转化株Southernblot结果3讨论牛支原体是引起肉牛和奶牛发病的一种重要病原·28·AnimalH
剐云桨迳仙?さ木??100×)M．DNA分子量标准;1－17.突变体样品依次为A304、A305、A307、A310～A323;18.pISM2062质粒;19.08MDNA;20.ddH2O图2牛支原体08M株转化子DNA的PCＲ分析2.4稳定性检测挑取的阳性突变体连续传10代后，PCＲ扩增仍可检测到400bp特异性目的片段，表明转座子可稳定存在于突变株中(图3)。M．DNA分子量标准;1－10.转化株样品(A027、A042、A044、A057、A060、A067、A076、A085、A347、A405);11.pISM2062质粒;12.08MDNA;13.ddH2O图3转化株传10代的PCＲ测定结果2.5转化株Southernblot测定如图4显示，挑选的A347和A405转化株在传5代和10代后，未检测到多次插入，表明转座子稳定存在于转化株基因组中。2个杂交条带分子量均在7500bp左右。M．DNA分子量标准;1，A347(5代);2.A405(5代);3.A347(10代);4.A405(10代);5.08M野生型图4转化株Southernblot结果3讨论牛支原体是引起肉牛和奶牛发病的一种重要病原·28·AnimalHusbandry＆VeterinaryMedicine2018Vol.50No.5
【参考文献】：
期刊论文
[1]牛支原体逃避宿主免疫的研究进展[J]. 季文恒,储岳峰,赵萍,陈胜利,郝华芳,王展慧,刘永生. 畜牧兽医学报. 2017(03)
[2]4种抗原定量方法观察牛支原体培养特征[J]. 王展慧,赵萍,陈胜利,郝华芳,秦明明,王绍伟,刘永生,储岳峰. 中国畜牧兽医. 2016(10)
[3]肉牛传染性牛支原体肺炎流行的诊断[J]. 石磊,龚瑞,尹争艳,周勇,裴洁,胡智斌,王利霞,胡长敏,刘涛,陈颖钰,廖娟红,赵俊龙,陈焕春,郭爱珍. 华中农业大学学报. 2008(05)
[4]国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体[J]. 辛九庆,李媛,郭丹,宋念华,胡守萍,陈超,裴洁,曹培丽. 中国预防兽医学报. 2008(09)
博士论文
[1]牛支原体表达载体的构建[D]. 李佳禾.中国农业大学 2015
本文编号：3464612
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3464612.html
