快速检测非洲猪瘟病毒环介导等温扩增方法的建立

发布时间：2021-10-31 13:22

　　非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种高致病率和死亡率的急性、烈性、接触性的传染病,强毒株感染后导致动物100%的死亡率,而目前针对非洲猪瘟还并没有有效的疫苗给以预防,该病对全球的养猪业造成了巨大的威胁和经济损失。我国目前虽然尚无非洲猪瘟疫病的发生,但是随着日渐频繁的进出口贸易发展,以及人员流动的来往,该病传入我国的可能性也随之增大。为了能及时的检测出非洲猪瘟,预防该病传入我国,因此建立一种快速高效检测非洲猪瘟病毒的实验室诊断方法显得非常重要,本研究在分子生物学的基础上,利用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）快速、简便的特性,建立了一种快速检测非洲猪瘟病毒LAMP方法。本试验根据NCBI已登录的非洲猪瘟K205R基因序列,人工合成该基因质粒作为试验所需模板。通过在线软件,根据LAMP引物设计原理,针对非洲猪瘟病毒K205R基因序列设计了一套特异性引物,在进行反应条件优化后成功建立了非洲猪瘟病毒的LAMP检测... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 非洲猪瘟概述
        1.1 病原学及其研究进展
            1.1.1 病毒的分类及结构特征
            1.1.2 病毒的理化特性
            1.1.3 病毒的主要蛋白
            1.1.4 病毒的侵入机理
            1.1.5 病毒免疫逃避机制
        1.2 流行病学及其研究进展
            1.2.1 易感动物和传染源
            1.2.2 地理分布及传播途径
        1.3 致病机理
        1.4 临床症状及病理变化
        1.5 实验室诊断方法
            1.5.1 病毒分离和免疫学检测
            1.5.2 分子生物学检测
        1.6 防治措施
    2. 环介导等温扩增概述
        2.1 技术特点
        2.2 反应原理
        2.3 引物设计
        2.4 反应体系
        2.5 应用实例
            2.5.1 LAMP技术在细菌方面的应用
            2.5.2 LAMP技术在病毒方面的应用
            2.5.3 LAMP技术在寄生虫方面的应用
    3. 研究目的与意义
第二章 非洲猪瘟LAMP检测方法的建立
    1 实验材料
        1.1 主要仪器
        1.2 实验主要试剂
        1.3 相关试剂的制备
    2 质粒模板的制备
        2.1 非洲猪瘟病毒质粒的制备
        2.2 病毒质粒浓度测定
        2.3 其他病毒DNA模板的制备
    3 非洲猪瘟病毒检测方法的建立
        3.1 引物设计与合成
        3.2 酶切位点分析
        3.3 引物的验证
        3.4 结果判定
        3.5 LAMP产物的鉴定
            3.5.1 LAMP产物酶切鉴定
            3.5.2 LAMP产物克隆测序鉴定
                3.5.2.1 LAMP产物的PCR扩增
                3.5.2.2 PCR扩增片段的凝胶回收
                3.5.2.3 感受态细胞的制备
                3.5.2.4 重组质粒的连接
                3.5.2.5 重组质粒的转化
                3.5.2.6 测序鉴定
        3.6 LAMP反应条件的优化
            3.6.1 反应温度的优化
            3.6.2 反应时间的优化
            3.6.3 镁离子浓度的优化
            3.6.4 dNTP浓度的优化
            3.6.5 内外引物比例优化
            3.6.6 甜菜碱的作用
        3.7 PCR检测条件的优化
        3.8 灵敏度试验
        3.9 特异性试验
        3.10 稳定性试验
    4. 结果与分析
        4.1 模板测序以及浓度的测定
        4.2 引物验证结果
        4.3 反应条件的优化
            4.3.1 反应温度的优化
            4.3.2 反应时间的优化
            4.3.3 镁离子浓度的优化
            4.3.4 dNTP浓度的优化
            4.3.5 外内引物浓度比例的优化
            4.3.6 甜菜碱的作用
        4.4 LAMP反应条件的确立
        4.5 非洲猪瘟病毒LAMP可视化检测
        4.6 LAMP产物的鉴定
            4.6.1 LAMP产物酶切鉴定
            4.6.2 LAMP产物克隆测序鉴定
        4.7 PCR反应条件确立
        4.8 LAMP灵敏性试验
        4.9 LAMP特异性试验
        4.10 LAMP稳定性试验
    5. 讨论
        5.1 选题的必要性
        5.2 非洲猪瘟病毒质粒模板的制备
        5.3 建立本方法的技术优势
        5.4 反应条件对LAMP的影响
            5.4.1 温度对LAMP反应的影响
            5.4.2 镁离子对LAMP反应的影响
            5.4.3 引物比例对LAMP反应的影响
            5.4.4 其他因素对LAMP反应的影响
        5.5 假阳性分析及应对
    6 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]2007-2012年非洲猪瘟在高加索和俄罗斯的流行情况[J]. 翁善钢.  养猪. 2013(03)
[2]非洲猪瘟流行病学研究进展[J]. 包静月,王志亮.  中国动物检疫. 2013(06)
[3]非洲猪瘟病毒感染机制和诊断方法的研究进展[J]. 李洪利,张维,李慧,王君玮,曹金山.  中国预防兽医学报. 2012(10)
[4]LAMP技术快速检测沙门氏菌方法的建立及其应用[J]. 田桢干,阎俊,陆晔,王婷,章琪,张胜萍,王传贵.  中国国境卫生检疫杂志. 2011(05)
[5]LAMP（环介导等温扩增）的原理及在寄生虫检测上的应用[J]. 史亚东,赵子方,朱丹,张龙现,宁长申,菅复春.  中国人兽共患病学报. 2011(10)
[6]非洲猪瘟的主要实验室诊断技术[J]. 王宏燕,顾贵波.  养猪. 2011(04)
[7]非洲猪瘟病毒环介导恒温扩增快速检测技术的建立及应用[J]. 杨吉飞,关贵全,刘志杰,汪月凤,李有全,马米玲,刘爱红,任巧云,苟惠天,杜鹏飞,罗建勋,殷宏.  中国动物传染病学报. 2011(04)
[8]应用LAMP快速检测金黄色葡萄球菌的研究[J]. 唐梦君,周生,葛庆联,张小燕,蒲俊华,高玉时.  现代食品科技. 2011(06)
[9]猪瘟病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立[J]. 赵明秋,王伟芳,王波,康艳梅,高健潜,陈金顶.  广东畜牧兽医科技. 2011(02)
[10]非洲猪瘟的研究进展[J]. 温肖会,魏文康,黄忠,吕殿红.  广东农业科学. 2010(10)

硕士论文
[1]非洲猪瘟病毒VP73基因和主要抗原表位区的原核表达及其ELISA检测方法的建立[D]. 李秋霞.西北农林科技大学 2010
[2]非洲猪瘟病毒K205R基因检测方法研究[D]. 郭少平.内蒙古农业大学 2010



本文编号：3468210