猪圆环病毒2型捕获ELISA抗体检测方法的建立与临床应用
发布时间：2021-10-31 22:51
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus2, PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）等相关疾病的主要病原。PMWS发病猪多为断奶仔猪和育肥猪,表现为精神沉郁、呼吸急促、厌食、黄疸、贫血、进行性消瘦或生长迟缓等。随着国际贸易交流的广泛开展,PCV2在全球呈现出流行趋势,给养猪业造成了巨大的影响,也给社会带来了巨大的经济损失,一种快速、准确的诊断方法对疾病的防控显得十分重要。本研究制备了PCV2单克隆抗体,建立了捕获ELISA抗体检测方法,并与间接ELISA方法进行了临床应用比较研究。PCV2单克隆抗体的制备：PCV2的ORF2基因编码病毒的结构蛋白（Cap）,也是区分PCV1与PCV2的重要区域,其编码蛋白（Cap）具有良好的免疫原性。本实验以Cap蛋白为抗原免疫6-8周龄的雌性Balb/C小鼠,将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选与亚克隆后共得到5株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2D3、3E10、1C5、3H11、4F9。将杂交瘤细胞对Balb/C小鼠进行腹腔注射,收集腹水并用间接ELISA方法检测腹水的抗体效价滴度...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 文献综述
1.1 猪圆环病毒研究进展
1.1.1 猪圆环病毒的病原学研究进展
1.1.2 猪圆环病毒2型的流行病学研究
1.1.3 猪圆环病毒2型的致病机理研究
1.1.4 猪圆环病毒2型的致病性
1.2 猪圆环病毒2型检测方法研究进展
1.2.1 抗原的检测方法
1.2.2 抗体的检测方法
1.3 猪圆环病毒2型单克隆抗体研究进展
2 研究的目的及意义
3 实验材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 抗原、血清、细胞及实验动物
3.1.2 培养基及主要试剂
3.1.3 主要溶液及其配制
3.1.4 主要仪器设备
3.2 猪圆环病毒2型单克隆抗体的制备
3.2.1 单克隆抗体制备的技术流程
3.2.2 抗原的制备及SDS-PAGE电泳
3.2.3 动物免疫
3.2.4 SP2/0骨髓瘤细胞的制备
3.2.5 免疫脾细胞的制备
3.2.6 饲养细胞的制备
3.2.7 细胞融合
3.2.8 间接ELISA方法筛选阳性克隆
3.2.9 有限稀释法亚克隆
3.2.10 腹水的制备
3.2.11 腹水抗体的纯化
3.2.12 单克隆抗体的Western Blot鉴定
3.3 猪圆环病毒2型捕获ELISA抗体检测方法的建立
3.3.1 捕获ELISA程序
3.3.2 包被抗体最佳浓度与捕获抗原最佳浓度的确定
3.3.3 捕获抗原最佳温育时间的确定
3.3.4 按照已优化的条件包被96孔酶标板
3.3.5 被检血清最佳稀释度的确定
3.3.6 被检血清最佳反应时间的确定
3.3.7 酶标二抗最佳工作浓度的确定
3.3.8 酶标二抗最佳反应时间的确定
3.3.9 临界值的确定
3.3.10 敏感性试验
3.3.11 特异性试验
3.3.12 重复性试验
3.4 猪圆环病毒2型捕获ELISA抗体检测方法的临床应用
4 结果与分析
4.1 猪圆环病毒2型单克隆抗体的制备
4.1.1 抗原的SDS-PAGE分析
4.1.2 抗原的最佳包被浓度
4.1.3 免疫小鼠抗体效价的测定
4.1.4 细胞融合结果及亚克隆
4.1.5 杂交瘤细胞培养上清的效价测定
4.1.6 腹水效价的测定
4.1.7 单克隆抗体的Western Blot鉴定
4.2 猪圆环病毒2型捕获ELISA抗体检测方法的建立
4.2.1 包被抗体最佳浓度与捕获抗原最佳浓度的确定
4.2.2 捕获抗原最佳温育时间的确定
4.2.3 被检血清最佳稀释度的确定
4.2.4 被检血清最佳反应时间的确定
4.2.5 酶标二抗最佳工作浓度的确定
4.2.6 酶标二抗最佳反应时间的确定
4.2.7 临界值的确定
4.2.8 敏感性试验
4.2.9 特异性试验
4.2.10 重复性试验
4.3 临床血清检测结果
5 讨论与结论
5.1 讨论
5.2 结论
参考文献
致谢
本文编号：3469011
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 文献综述
1.1 猪圆环病毒研究进展
1.1.1 猪圆环病毒的病原学研究进展
1.1.2 猪圆环病毒2型的流行病学研究
1.1.3 猪圆环病毒2型的致病机理研究
1.1.4 猪圆环病毒2型的致病性
1.2 猪圆环病毒2型检测方法研究进展
1.2.1 抗原的检测方法
1.2.2 抗体的检测方法
1.3 猪圆环病毒2型单克隆抗体研究进展
2 研究的目的及意义
3 实验材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 抗原、血清、细胞及实验动物
3.1.2 培养基及主要试剂
3.1.3 主要溶液及其配制
3.1.4 主要仪器设备
3.2 猪圆环病毒2型单克隆抗体的制备
3.2.1 单克隆抗体制备的技术流程
3.2.2 抗原的制备及SDS-PAGE电泳
3.2.3 动物免疫
3.2.4 SP2/0骨髓瘤细胞的制备
3.2.5 免疫脾细胞的制备
3.2.6 饲养细胞的制备
3.2.7 细胞融合
3.2.8 间接ELISA方法筛选阳性克隆
3.2.9 有限稀释法亚克隆
3.2.10 腹水的制备
3.2.11 腹水抗体的纯化
3.2.12 单克隆抗体的Western Blot鉴定
3.3 猪圆环病毒2型捕获ELISA抗体检测方法的建立
3.3.1 捕获ELISA程序
3.3.2 包被抗体最佳浓度与捕获抗原最佳浓度的确定
3.3.3 捕获抗原最佳温育时间的确定
3.3.4 按照已优化的条件包被96孔酶标板
3.3.5 被检血清最佳稀释度的确定
3.3.6 被检血清最佳反应时间的确定
3.3.7 酶标二抗最佳工作浓度的确定
3.3.8 酶标二抗最佳反应时间的确定
3.3.9 临界值的确定
3.3.10 敏感性试验
3.3.11 特异性试验
3.3.12 重复性试验
3.4 猪圆环病毒2型捕获ELISA抗体检测方法的临床应用
4 结果与分析
4.1 猪圆环病毒2型单克隆抗体的制备
4.1.1 抗原的SDS-PAGE分析
4.1.2 抗原的最佳包被浓度
4.1.3 免疫小鼠抗体效价的测定
4.1.4 细胞融合结果及亚克隆
4.1.5 杂交瘤细胞培养上清的效价测定
4.1.6 腹水效价的测定
4.1.7 单克隆抗体的Western Blot鉴定
4.2 猪圆环病毒2型捕获ELISA抗体检测方法的建立
4.2.1 包被抗体最佳浓度与捕获抗原最佳浓度的确定
4.2.2 捕获抗原最佳温育时间的确定
4.2.3 被检血清最佳稀释度的确定
4.2.4 被检血清最佳反应时间的确定
4.2.5 酶标二抗最佳工作浓度的确定
4.2.6 酶标二抗最佳反应时间的确定
4.2.7 临界值的确定
4.2.8 敏感性试验
4.2.9 特异性试验
4.2.10 重复性试验
4.3 临床血清检测结果
5 讨论与结论
5.1 讨论
5.2 结论
参考文献
致谢
本文编号：3469011
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