差速超速离心法与试剂盒法提取娟姗牛乳源性外泌体的分析比较

发布时间：2021-11-06 06:56

　　本试验旨在探究不同方法提取娟姗牛乳源性外泌体的优缺点。采用差速超速离心法和试剂盒法2种提取方法对娟姗牛乳源性外泌体进行提取,通过透射电镜（TEM）、Bradford蛋白定量、免疫印迹（WB）和粒径分析（NTA）方法对2种提取方法得到的外泌体进行比较鉴定,并采用细胞毒性试验对试剂盒法提取的外泌体进行细胞毒性评估。结果显示:2种提取方法均获得了茶托样结构的囊泡,但TEM视野下试剂盒法提取的外泌体较差速超速离心法多。试剂盒法提取的外泌体蛋白浓度显著高于差速超速离心法（P<0.05）。2种提取方法均能够检测到外泌体的标志性蛋白凋亡连接基因2相互作用蛋白X（ALIX）和四次跨膜蛋白（CD81）;差速超速离心法提取的外泌体CD81蛋白丰度极低,且并未鉴定出标志性蛋白肿瘤敏感基因101蛋白（TSG101）,但试剂盒法检测到了TSG101。2种提取方法得到的外泌体粒径分布均符合外泌体的正常粒径大小（30～150 nm）。进一步通过细胞毒性试验发现,试剂盒法提取的外泌体对细胞的增殖分化几乎没有影响。因此,基于本试验条件下,试剂盒法更适用于提取娟姗牛乳源性外泌体。 

【文章来源】：动物营养学报. 2020,32(11)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

外泌体的粒径检测结果

从图1可以看出，通过TEM方法分别对差速超速离心法及试剂盒法提取得到的外泌体进行了鉴定，2种提取方法得到的外泌体都拍到了典型的茶托样结构，电镜下观察到的囊泡大小在100 nm左右。图1-A为差速超速离心法提取得到的外泌体，电镜下观察到的外泌体较少；图1-B为试剂盒法提取得到的外泌体，电镜下观察到的外泌体较多。2.2 Bradford蛋白定量方法鉴定不同方法提取的娟姗牛乳源性外泌体的蛋白浓度

从图3可以看出，通过对不同提取方法提取的外泌体的蛋白进行鉴定发现，图3-A中差速超速离心法提取的蛋白条带很杂，在相对蛋白分子量大的部分，蛋白条带很弱，在相对蛋白分子量小的位置，条带不规则；试剂盒法提取的各蛋白条带都比较清晰，蛋白条带也较多。通过WB方法对差速超速离心法和试剂盒法提取的外泌体进行了标志性蛋白CD81、ALIX和TSG101的鉴定，结果显示，2种提取方法均能够检测到外泌体的标志性蛋白ALIX和CD81，但差速超速离心法提取的外泌体标志性蛋白CD81蛋白丰度特别低，且并未鉴定出标志性蛋白TSG101，但试剂盒法检测到了标志性蛋白TSG101,Calnexin作为外泌体阴性对照，2种提取方法均未检测到Calnexin（图3-B）。2.4 NTA方法鉴定不同方法提取的娟姗牛乳源性外泌体的粒径

【参考文献】：
期刊论文
[1]娟姗牛的杂交应用研究进展[J]. 汪翔.  中国奶牛. 2016(09)
[2]不同品种原料乳理化特性分析[J]. 梁霄,刘鹭,张书文,孙琦,吕加平.  食品科学. 2013(05)
[3]娟姗牛品种特性及适应性饲养研究[J]. 王洋,于静,王巍,张俊瑜,于清,王志明.  中国奶牛. 2011(11)



本文编号：3479393