CRISPR/Cas9介导鸡细胞PPARγ基因的敲除

发布时间：2021-11-06 20:48

　　在哺乳动物中,PPARγ能够调控许多参与脂肪细胞分化和脂质代谢的基因,并且广泛参与脂肪的吸收、运输、生成和分解等,但在鸡中关于该基因的研究还不够深入。CRISPR/Cas9技术通过sgRNA特异性识别含有PAM的靶DNA序列,Cas9蛋白对靶序列进行切割,然后通过细胞DNA修复机制进行修复从而实现基因组的高效编辑。本研究主要利用CRISPR/Cas9系统对鸡DF-1细胞系和原代前脂肪细胞PPARγ基因进行靶向敲除,从而为研究PPARγ基因在鸡脂肪细胞分化中的作用和生产转基因鸡奠定基础。1.为了利用CRISPR/Cas9系统对鸡DF-1细胞系和原代前脂肪细胞PPARγ基因进行靶向敲除,本研究在GenBank查找鸡PPARγ的基因组序列后,通过麻省理工学院的http://crispr.Mit.edu软件设计了1对sgRNA,成功构建了靶向PPARγ基因的pll3.7-U6-sgPPARγ-CMV-spCas9（sgPPARγ-Cas9）表达载体和pB-CMV-DsRed-CAG-PPARγ.200bp repeat.Puro-T2A-GFP（RPG-PPARγ）双荧光报告载体。2.为了验证... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 PPAR基因研究进展概述
        1.1.1 PPAR的类型和组织特异性表达
        1.1.2 PPARγ的结构和调控机制
        1.1.3 PPARγ在肥胖程度不同的个体中的表达规律
        1.1.4 PPARγ的配体
        1.1.5 PPARγ在脂肪形成的作用
        1.1.6 鸡PPARγ的调控模式
    1.2 CRISPR/Cas9技术
        1.2.1 CRISPR/Cas的免疫获得和分类
        1.2.2 CRISPR/Cas9的作用机理
        1.2.3 CRISPR/Cas9的应用
        1.2.4 CRISPR/Cas9的脱靶效应
    1.3 电穿孔转染技术
    1.4 SSA-RPG筛选报告系统
    1.5 目的与意义
第二章 CRISPR/Cas9系统的建立
    2.1 试验材料
        2.1.1 主要仪器设备
        2.1.2 主要试剂与试剂配置
        2.1.3 菌株和质粒
        2.1.4 引物序列
    2.2 试验方法
        2.2.1 PPARγ靶位点的选择
        2.2.2 CIRSPR-Cas9表达载体的构建
        2.2.3 RPG-PPARγ报告载体的构建
    2.3 试验结果
        2.3.1 CIRSPR-Cas9表达载体的构建
        2.3.2 RPG报告载体的构建
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 利用CRIPSR/Cas9系统敲除鸡DF1细胞系中PPARγ基因
    3.1 试验材料
        3.1.1 主要仪器
        3.1.2 主要试剂及试剂配制
        3.1.3 菌株，细胞系，质粒
    3.2 试验方法
        3.2.1 DF-1 细胞的培养
        3.2.2 DF-1 细胞的转染
        3.2.3 DF-1 阳性细胞的筛选与富集
        3.2.4 DF-1 细胞基因组水平的检测
        3.2.5 脱靶检测
    3.3 试验结果
        3.3.1 载体水平的检测
        3.3.2 阳性细胞的筛选与富集
        3.3.3 基因组水平的检测
        3.3.4 脱靶检测结果
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 利用CRIPSR/Cas9系统敲除鸡前脂肪细胞中PPARγ基因
    4.1 试验材料
        4.1.1 试验器材
        4.1.2 主要试剂及试剂配制
    4.2 试验方法
        4.2.1 鸡前脂肪细胞的分离和培养
        4.2.2 电穿孔法转染鸡前脂肪细胞
        4.2.3 前脂肪细胞嘌呤霉素的筛选
        4.2.4 前脂肪细胞基因组的检测
    4.3 试验结果
        4.3.1 前脂肪细胞的分离与培养
        4.3.2 CRISPR/Cas9在前脂肪细胞中报告载体水平的检测
        4.3.3 阳性前脂肪细胞嘌呤霉素的筛选
        4.3.4 基因组水平检测
    4.4 讨论
        4.4.1 前脂肪细胞的转染
        4.4.2 利用CRIPSR/Cas9系统敲除鸡前脂肪细胞中PPARγ基因
    4.5 小结
结论和创新点
参考文献
附录
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡PPARγ基因的表达特性及其对脂肪细胞增殖分化的影响[J]. 王丽,那威,王宇祥,王彦博,王宁,王启贵,李玉茂,李辉.  遗传. 2012(04)

博士论文
[1]肉牛PPARs家族和PLIN基因遗传变异及其与秦川牛胴体、肉质性状相关分析[D]. 樊月圆.西北农林科技大学 2010



本文编号：3480500