克氏伪裸头绦虫的鉴定及其遗传变异研究

发布时间：2017-05-06 12:11

  本文关键词：克氏伪裸头绦虫的鉴定及其遗传变异研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：克氏伪裸头绦虫(Pseudanoplocephala crawfordi)是一种重要的人兽共患绦虫,该绦虫最初发现于斯里兰卡野猪体内,之后相继发现于印度、中国、日本的猪体内,其主要寄生在猪小肠内,引起仔猪生长发育受阻、消瘦、腹痛和腹泻甚至死亡,降低饲料转化率,对养殖业造成重大的经济损失。人可因误食含有该绦虫幼虫的赤拟谷盗等昆虫而感染,目前国内已有21例人感染的报道。准确鉴定该绦虫和明确其种群遗传特征是制定预防和控制克氏伪裸头绦虫对人和动物危害有效措施的关键。基于此,本论文从以下四个方面研究了克氏伪裸头绦虫的鉴定方法和遗传变异特点。1.通过对采自陕西杨凌自然感染的猪体内的克氏伪裸头绦虫不同染色和形态学观察发现,苏木精染液对成虫的头节、颈节、幼节和成节效果较好,而齐氏石碳酸品红染液对孕卵节片较为理想。通过观察虫体标本,初步鉴定为克氏伪裸头绦虫。2.扩增克氏伪裸头绦虫核糖体DNA内转录间隔区(ITS rDNA)并克隆、测序和序列分析,发现克氏伪裸头绦虫ITS全长为1586 bp,其中ITS1为757 bp,5.8S为201 bp,ITS2为628 bp。分别基于ITS1和ITS2构建绦虫种系发育树,可见克氏伪裸头绦虫与膜壳属绦虫聚在一起,表明克氏伪裸头绦虫可能属于膜壳属。3.扩增克氏伪裸头绦虫细胞色素C氧化酶亚基1基因部分片段(pcox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1基因(nad1)部分片段(pnad1),并测序和序列分析,发现pcox1和pnad1长度分别为380 bp和458 bp。分别基于pcox1和pnad1构建进化树,发现pcox1可能不适合作为分子标记,而pnad1适合作为遗传标记来研究绦虫的种系发育。4.测定和分析了克氏伪裸头绦虫线粒体全基因组,发现该绦虫线粒体全基因组全长14192 bp,共编码36个基因,其中12个蛋白编码基因,2个核糖体RNA基因和22个转移RNA。基因的排列顺序与缩小膜壳绦虫完全一致,而与其他绦虫仅有有2个tNAR基因排列顺序相颠倒。基于12个蛋白编码基因氨基酸序列重建绦虫种系发育树,表明克氏伪裸头绦虫可能属于膜壳属,并与缩小膜壳绦虫亲缘关系最近。5.扩增和测定了河南洛阳、济源和陕西杨凌地区猪的克氏伪裸头绦虫分离株线粒体cox3基因的部分片段(pcox3)、nad4基因的部分片段(pnad4)和cytb基因的部分片段(pcytb),然后通过合并pcox3、pnad4和pcytb三段序列重建了克氏伪裸头绦虫与其它绦虫的种群遗传关系。发现克氏伪裸头绦虫pcox3、pnad4和pcytb扩增片段的长度分别为503 bp、604 bp和690 bp;克氏伪裸头绦虫线粒体三段基因pcox3、pnad4和pcytb的不同地域种内序列差异分别为0~1.83%、0~1.52%和0~1.51%;基于合并cox3、nad4和cytb三段基因重构种系发育树发现,不同地区克氏伪裸头绦虫分离株聚在一起,并与缩小膜壳绦虫形成姊妹支,而所有的克氏伪裸头绦虫分离株又形成两个小的分支。表明克氏伪裸头绦虫可能存在两个种群,并且与缩小膜壳绦虫亲缘关系最近。
【关键词】：克氏伪裸头绦虫 鉴定 遗传变异 线粒体基因组
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 文献综述13-19
• 第一章 克氏伪裸头绦虫研究概况13-19
• 1.1 克氏伪裸头绦虫13-14
• 1.1.1 分类学地位13
• 1.1.2 形态学和生活史13
• 1.1.3 生活史13-14
• 1.2 克氏伪裸头绦虫病14-15
• 1.2.1 流行病学研究14
• 1.2.2 诊断14
• 1.2.3 防治14-15
• 1.3 寄生虫分子分类的研究15-16
• 1.3.1 聚合酶链式反应 限制性片断长度多态性（PCR RFLP）15
• 1.3.2 长PCR（Long-range PCR）扩增技术15-16
• 1.4 绦虫分类学和分子遗传学研究16-18
• 1.4.1 形态学分类研究16
• 1.4.2 分子生物学分类及遗传学研究16-18
• 1.4.2.1 核糖体基因特点及在蠕虫研究中的应用16-17
• 1.4.2.2 线粒体基因特点及在蠕虫虫研究中的应用17-18
• 1.5 本研究的目的和意义18-19
• 试验研究19-48
• 第二章 克氏伪裸头绦虫形态学观察19-23
• 2.1 材料与方法19-20
• 2.1.1 材料19
• 2.1.1.1 虫种19
• 2.1.1.2 主要试剂19
• 2.1.1.3 溶液及其配制19
• 2.1.1.4 主要仪器19
• 2.1.2 方法19-20
• 2.1.2.1 虫体采集及处理19-20
• 2.1.2.2 染色镜检20
• 2.1.2.3 形态学观察20
• 2.2 结果20-22
• 2.2.1 克氏伪裸头绦虫标本的制作20
• 2.2.2 头节的形态学结构20-21
• 2.2.3 体节（幼节、成节和孕节）的形态学观察21-22
• 2.3 讨论22
• 2.4 小结22-23
• 第三章 克氏伪裸头绦虫ITS、cox1和nad1基因的扩增与种系发育分析23-34
• 3.1 材料与方法23-29
• 3.1.1 材料23-24
• 3.1.1.1 虫种23
• 3.1.1.2 主要试剂23
• 3.1.1.3 溶液及其配制23-24
• 3.1.1.4 主要仪器24
• 3.1.2 方法24-29
• 3.1.2.1 虫体鉴定和DNA提取24-25
• 3.1.2.2 样品ITS rDNA的扩增25-26
• 3.1.2.3 PCR产物的检测26
• 3.1.2.4 PCR产物纯化回收26-27
• 3.1.2.5 纯化PCR产物的连接27
• 3.1.2.6 连接产物的转化27-28
• 3.1.2.7 转化子菌液鉴定28
• 3.1.2.8 测序及进化分析28-29
• 3.2 结果29-32
• 3.2.1 ITS扩增结果29
• 3.2.2 cox1和nad1基因PCR扩增结果29-30
• 3.2.3 克氏伪裸头绦虫ITS rDNA序列分析30
• 3.2.4 克氏伪裸头绦虫pcox1和pnad1基因序列分析30
• 3.2.5 基于ITS rDNA序列的种系发育分析30-31
• 3.2.6 基于pcox1和pnad1基因的种系发育关系分析31-32
• 3.3 讨论32-33
• 3.4 小结33-34
• 第四章 克氏伪裸头绦虫线粒体基因组分析34-42
• 4.1 材料与方法34-37
• 4.1.1 材料34
• 4.1.1.1 虫种34
• 4.1.1.2 主要试剂34
• 4.1.1.3 溶液配制34
• 4.1.1.4 主要仪器34
• 4.1.2 方法34-37
• 4.1.2.1 样品处理、鉴定及DNA提取34
• 4.1.2.2 引物设计34-35
• 4.1.2.3 克氏伪裸头绦虫线粒体基因组长PCR扩增方法35-36
• 4.1.2.4 PCR产物的回收36
• 4.1.2.5 纯化PCR产物的连接36
• 4.1.2.6 连接产物的转化36
• 4.1.2.7 转化产物的克隆及菌液PCR鉴定36
• 4.1.2.8 克氏伪裸头绦虫线粒体基因组序列分析36-37
• 4.1.2.9 基于线粒体基因组的线虫系统进化树重构37
• 4.2 结果37-41
• 4.2.1 细颈线虫线粒体基因组的组成37
• 4.2.2 蛋白质编码基因分析37-38
• 4.2.3 基于线粒体基因组的线虫系统进化分析38-41
• 4.3 讨论41
• 4.4 小结41-42
• 第五章 克氏伪裸头绦虫线粒体cox3、nad4和cytb基因多态性研究42-48
• 5.1 材料与方法42-43
• 5.1.1 材料42-43
• 5.1.1.1 虫种42
• 5.1.1.2 主要试剂、溶液和仪器42-43
• 5.1.2 方法43
• 5.1.2.1 样品处理、鉴定及DNA提取43
• 5.1.2.2 样品cox3、nad4和cytb基因的扩增43
• 5.1.2.3 序列分析及系统进化树重构43
• 5.2 结果43-46
• 5.2.1 克氏伪裸头绦虫cox3、nad4和cytb基因PCR扩增结果43-45
• 5.2.2 测序结果及序列分析45
• 5.2.3 种群系统进化分析45-46
• 5.3 讨论46-47
• 5.4 小结47-48
• 结论48-49
• 参考文献49-54
• 附录54-59
• 附录1 克氏伪裸头绦虫ITS序列54-55
• 1.1 克氏伪裸头绦虫ITS1序列54
• 1.2 克氏伪裸头绦虫 5.8 S序列54
• 1.3 克氏伪裸头绦虫ITS2序列54-55
• 附录2 克氏伪裸头绦虫线粒体基因组序列55-59
• 2.1 克氏伪裸头绦虫线粒体基因组序列55-59
• 致谢59-60
• 作者简介60

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本文编号：348378