PI3K-Akt通路对ORFV复制及其感染宿主细胞凋亡过程的影响

发布时间：2017-05-06 08:10

  本文关键词：PI3K-Akt通路对ORFV复制及其感染宿主细胞凋亡过程的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)为痘病毒科(Poxviridae)脊索亚科(Chordopoxvirinae)副痘病毒属(Parapoxvirus)代表性成员之一,是一种重要的人兽共患病病原,能够感染引起绵羊、山羊等反刍动物以及人的一种急性、高度接触性传染病,临床上以在感染动物口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和疣状厚痂为主要特征。近年来,Orf在世界各地羊群中频繁暴发流行,我国甘肃、新疆、内蒙、吉林等一些主要养羊省区羊群中也不断有该病暴发流行的报道。ORFV自身所具有的免疫逃避特性以及缺乏有效防控措施很可能是导致该病在羊群中暴发流行增多的重要原因。目前,由于存在对其介导的宿主免疫和致病机制研究深度不够等问题,导致用于羊传染性脓疱病防治的新疫苗和新药物的开发研制仍面临严峻挑战。鉴于上述情况,加强对ORFV的基础研究(基因、蛋白、作用机制等)十分必要,尤其是对ORFV致病分子机制的研究。为了全面解析ORFV致病分子机制,本课题组前期从病毒与宿主互作角度出发,利用Illumina/Solexa高通量测序技术成功构建了ORFV感染前后宿主细胞m RNA差异表达谱,经Gene Ontology分析筛选出多条差异表达基因,其中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol kinase 3-kinase,PI3K)在感染后48 h和96 h呈现显著上调表达。PI3K是一种重要的胞内磷脂酰肌醇激酶,主要参与PI3K-Akt等经典信号通路,在细胞增殖、细胞周期调节、分化和凋亡等方面具有重要作用,多种病毒都通过对宿主细胞PI3K-Akt信号通路的调控而实现对宿主细胞的感染。然而,目前尚不清楚ORFV感染是否能够激活宿主细胞中的PI3K-Akt信号通路,同时对PI3K-Akt信号通路在ORFV感染过程中的作用,以及其对ORFV感染宿主细胞凋亡影响也知之甚少。本研究首先利用荧光定量PCR、Western blotting方法分别从基因转录水平和蛋白表达水平对感染不同时间段(3、6、12、24、48、72 h)PI3K的表达变化规律进行分析,与未接毒细胞相比,PI3K在感染后不同时间段均呈上升趋势,且随着感染时间延长而增加,该结果与前期构建的m RNA表达谱分析结果相一致。接下来我们对ORFV感染是否能够激活宿主细胞中的PI3K-Akt信号通路进行探讨,使用能够特异性识别磷酸化Akt的抗体(p-S473)进行Western blotting检测发现,磷酸化Akt水平在3 hpi(hours post-infection)出现显著升高,直至48 hpi仍能检测到较高水平的磷酸化Akt,上述结果表明ORFV感染Hela细胞过程中PI3K-Akt信号通路被活化。为进一步明确PI3K-Akt信号途径对ORFV侵染复制的影响,利用PI3K特异性抑制剂LY294002对PI3K进行抑制处理后接种ORFV,收集感染后不同时间段(12、24、48、72 h)细胞进行定量PCR检测和TCID50测定,结果显示,加入LY294002处理后,其病毒滴度低于接毒后未处理细胞组,由此可见阻断该通路对ORFV的入侵具有抑制作用。上述研究结果表明,PI3K-Akt通路对ORFV在宿主细胞中的复制增殖具有明显的促进作用。由于PI3K-Akt信号通路在调控细胞凋亡过程中也发挥着重要作用,因此本研究进一步探讨了ORFV感染过程中PI3K-Akt信号通路对宿主细胞凋亡的影响。利用LY294002阻断PI3K-Akt信号通路后,经免疫荧光观察、流式检测发现ORFV感染Hela细胞中出现明显的凋亡现象,该结果表明PI3K-Akt信号通路能够抑制ORFV诱导的Hela细胞凋亡。为了进一步明确PI3K-Akt信号通路抑制ORFV诱导的Hela细胞凋亡的途径,本研究利用Western blotting等方法对PI3K-Akt通路下游关键分子蛋白GSK-3β、MDM2和Bad的变化情况进行检测,结果显示,与ORFV正常感染Hela细胞相比,使用LY294002抑制剂的ORFV感染Hela细胞,在感染后6 h和24 h细胞中Bad/β-actin比值发生显著变化,而MDM2/β-actin和GSK-3β/β-actin比值都未见明显变化。上述结果表明,PI3K-Akt信号通路可能通过下游的Bad分子抑制ORFV感染Hela细胞过程中凋亡现象的发生。上述研究结果显示,PI3K-Akt信号通路对ORFV在Hela细胞的复制增殖具有明显的促进作用,并可能通过下游的Bad途径来抑制ORFV感染Hela细胞凋亡的产生而有益于ORFV的复制增殖。该研究结果不仅有利于深入理解ORFV的感染及致病机制,而且对针对该病的预防和治疗具有重要意义。
【关键词】：PI3K-Akt通路 羊传染性脓疱病毒 LY294002 复制 细胞凋亡 Bad
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩写词表11-13
• 前言13-15
• 第一篇 文献综述15-30
• 第一章 羊传染性脓疱病的研究进展15-24
• 1.1 流行病学特点15-16
• 1.2 病原学研究16-19
• 1.3 作为病毒载体的应用19
• 1.4 致病机制研究19-21
• 1.5 诊断与防治21-24
• 第二章 PI3K-Akt信号通路的研究24-30
• 2.1 PI3K-Akt信号通路概述24-25
• 2.2 PI3K-Akt信号通路的分子生物学功能25-27
• 2.3 PI3K-Akt信号通路在病毒感染过程中的研究27-28
• 2.4 PI3K-Akt信号通路的抗凋亡作用28
• 2.5 小结28-30
• 第二篇 研究内容30-74
• 第一章 磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）在ORFV感染过程中变化规律研究30-47
• 1.1 材料与方法30-39
• 1.2 结果39-44
• 1.3 讨论44-46
• 1.4 小结46-47
• 第二章 PI3K-Akt信号通路对ORFV复制增殖的影响47-60
• 2.1 材料与方法48-52
• 2.2 结果52-57
• 2.3 讨论57-59
• 2.4 小结59-60
• 第三章 PI3K-Akt信号通路对ORFV感染宿主细胞凋亡的影响60-74
• 3.1 材料与方法61-65
• 3.2 结果65-70
• 3.3 讨论70-73
• 3.4 小结73-74
• 结论74-75
• 参考文献75-90
• 导师简介90-91
• 作者简介91-92
• 致谢92

【参考文献】

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本文编号：348040