PI3K/Akt信号通路调控胞内布鲁氏菌16M存活的分子机制研究
发布时间:2021-11-09 13:20
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引发的一种人畜共患传染病。布鲁氏菌能够抑制细胞的凋亡和促进细胞的自噬,导致布鲁氏菌在吞噬细胞中生存繁殖,它能引起人、畜多器官损伤和慢性感染,给人类健康和畜牧业和谐发展带来严重威胁。已有研究表明PI3K/Akt信号通路不仅参与细胞凋亡、自噬等多种细胞活动和生物学效应还与病原体在细胞内的生存繁殖密切相关,然而,该信号通路否参与了布鲁氏菌在宿主细胞内的生存繁殖尚鲜有报道,本研究通过探讨PI3K/Akt信号通路对胞内布鲁氏菌生存繁殖的影响及与布鲁氏菌介导的细胞凋亡、自噬的影响,揭示布鲁氏菌在巨噬细胞内持续性感染的分子机制,为布鲁氏菌病新药物研发、防治及家畜抗病育种工作奠定基础。目的:(1)检测布鲁氏菌及脂多糖是否激活小鼠巨噬细胞的PI3K/Akt信号通路。(2)阻断PI3K/Akt信号通路后检测对羊种布鲁氏菌16M生存繁殖在宿主体内外的影响。(3)阻断PI3K/Akt信号通路后检测对羊种布鲁氏菌16M介导的细胞凋亡的影响。(4)阻断PI3K/Akt信号通路后检测对羊种布鲁氏菌16M介导的细胞自噬的影响。(5)检测PI3K催化亚基p110α在羊种布...
【文章来源】:石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校
【文章页数】:159 页
【学位级别】:博士
【文章目录】:
摘要
ABSTRACT
缩略词
引言
第一章 文献综述
综述一 布鲁氏菌病发病的分子机制研究
1 布鲁氏菌生物学特征
2 布鲁氏菌的致病机制
2.1 布鲁氏菌的侵袭和胞内生存
2.2 布鲁氏菌毒力相关因子
2.3 布鲁氏菌与细胞凋亡
2.4 布鲁氏菌与细胞自噬
3 布鲁氏菌免疫机制
4 PI3K/AKT信号转导通路
第二章 实验部分
实验一 布鲁氏菌对PI3K/AKT信号通路的激活
摘要
1 材料与方法
2 结果
2.1 羊种布鲁氏菌 16M对PI3K/Akt信号通路的激活
2.2 不同MOI的 16M对PI3K/Akt信号通路的激活
2.3 粗糙型和光滑型菌株对PI3K/Akt信号通路的激活
2.4 粗糙型和光滑型菌株的LPS对PI3K/Akt信号通路的激活
2.5 抑制剂LY对 16M介导的PI3K/Akt信号通路的阻断
2.6 抑制剂LY对巨噬细胞活性的影响
3 讨论
3.1 PI3K/Akt信号通路与疾病的关系
3.2 布鲁氏菌对PI3K/Akt信号通路的激活
3.3 脂多糖在激活PI3K/Akt信号通路中的作用
3.4 外膜蛋白对PI3K/Akt信号通路的激活
实验二 阻断PI3K/AKT信号通路对羊种布鲁氏菌 16M存活的影响
摘要
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 阻断PI3K/Akt信号通路抑制 16M的内化
2.2 阻断PI3K/Akt信号通路抑制 16M的胞内繁殖
2.3 阻断PI3K/Akt信号通路诱导 16M介导的IFN-γ、IL-12p70 和TNF-α的产生
2.4 LY在小鼠体内阻断 16M介导的PI3K/Akt信号通路
2.5 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M介导的小鼠产生的细胞因子的影响
2.6 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M介导的小鼠体内细胞亚群CD4+T和CD8+T细胞的影响
2.8 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M导致的小鼠内脏病理变化的影响
2.9 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M在小鼠体内存活的影响
2.10 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M导致的小鼠致死率的影响
3 讨论
3.1 细胞因子与布鲁氏菌感染
3.2 CD4~+和CD8~+T细胞与布鲁氏菌感染
3.3 布鲁氏菌导致机体的病理变化
实验三 阻断PI3K/AKT信号通路对羊种布鲁氏菌 16M介导细胞凋亡的影响
摘要
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M介导caspase-3、caspase-8 和caspase-9 活性的影响
2.2 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M介导凋亡相关基因的影响
2.3 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M介导凋亡相关蛋白的影响
2.4 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M介导细胞凋亡率的影响
2.5 抑制剂Z-DEVD-fmk、Z-IETD-fmk、Z-LEHD-fmk和LY对细胞活性的影响。
2.6 Z-DEVD-fmk和Z-LEHD-fmk对 16M介导的caspase-3 和caspase-9 活性的影响
2.8 抑制剂Z-DEVD-fmk、Z-IETD-fmk、Z-LEHD-fmk对LY诱导 16M介导的细胞凋亡率的影响
2.9 抑制caspase-3 或caspase-9 活性对 16M介导的p-Akt(S473)表达的影响
3 讨论
3.1 病原菌与细胞凋亡
3.2 Akt与细胞凋亡
3.3 PARP与细胞凋亡
3.4 Caspase途径与细胞凋亡
实验四 阻断PI3K/AKT信号通路对羊种布鲁氏菌 16M介导细胞自噬的影响
摘要
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 Plex-MSC-EGFP-LC3 质粒的酶切验证
2.2 慢病毒的包装及转染效果观察
2.3 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M诱导的细胞中GFP-LC3 阳性点数的影响
2.4 阻断PI3K/Akt信号通路对自噬相关基因mRNA水平的影响
2.5 阻断PI3K/Akt信号通路对自噬相关基因蛋白水平的影响
2.6 阻断PI3K/Akt信号通路对LysoTracker和LC3 共定位的影响
2.7 阻断PI3K/Akt信号通路对细胞中的自噬泡影响
3 讨论
3.1 细胞自噬利于布鲁氏菌的存活
3.2 LC3 蛋白与细胞自噬
3.3 自噬溶酶体途径与布鲁氏感染
3.4 PI3K/Akt信号通路与细胞自噬
实验五 PI3K催化亚基P110Α在羊种布鲁氏菌 16M侵染巨噬细胞过程中的功能
摘要
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 pLentiLox-siRNA载体的构建
2.2 慢病毒干扰载体的包装及转染效果观察
2.3 实时荧光定量PCR检测干扰片段抑制效果
2.4 沉默p110α基因对巨噬细胞活性的影响
2.5 沉默p110α基因对 16M激活PI3K/Akt信号通路的影响
2.6 沉默p110α基因对 16M在巨噬细胞中内化的影响
2.7 沉默p110α基因对 16M在巨噬细胞内存活的影响
2.8 沉默p110α基因对 16M介导的凋亡相关基因的影响
2.9 沉默p110α基因对 16M介导的细胞凋亡率的影响
2.10 沉默p110α基因对 16M自噬相关基因表达的影响
2.11 沉默p110α基因对 16M凋亡和自噬相关蛋白表达的影响
3 讨论
3.1 RNA干扰机制
3.2 RNA干扰慢病毒载体的优点
3.3 PI3K亚单位结构
3.4 P13Kp110α的功能
全文结论
创新点
参考文献
致谢
个人简介
附件
【参考文献】:
期刊论文
[1]伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡机制的探讨[J]. 刘婷婷,马丽娜,李凤云,刘勇,樊蓉. 中国人兽共患病学报. 2010(03)
[2]布鲁氏菌病的流行、发病原因及防治进展[J]. 周艳彬,柳晓琳. 辽宁医学院学报. 2010(01)
[3]布鲁氏菌病的研究与防控进展[J]. 任洪林,卢士英,周玉,李兆辉,柳增善. 中国畜牧兽医. 2009(09)
[4]中国布鲁氏菌病疫情监测与控制[J]. 崔步云. 疾病监测. 2007(10)
[5]PI3K在BCR/ABL阳性细胞中促进细胞周期进程和抗凋亡的作用[J]. 彭辉,冯文莉. 国外医学(临床生物化学与检验学分册). 2005(10)
[6]Huntingtin processing in pathogenesis of Huntington disease[J]. Zheng-hong QIN, Zhen-lun GUDepartment of Pharmacology, Soochow University School of Medicine, Suzhou 215 007, China; Laboratory of Cellular Neurobiology, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, MA 02129, USA. Acta Pharmacologica Sinica. 2004(10)
[7]布鲁氏菌病感染与免疫研究近况(续前)[J]. 尚德秋. 中国地方病防治杂志. 2003(03)
本文编号:3485425
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【文章页数】:159 页
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【文章目录】:
摘要
ABSTRACT
缩略词
引言
第一章 文献综述
综述一 布鲁氏菌病发病的分子机制研究
1 布鲁氏菌生物学特征
2 布鲁氏菌的致病机制
2.1 布鲁氏菌的侵袭和胞内生存
2.2 布鲁氏菌毒力相关因子
2.3 布鲁氏菌与细胞凋亡
2.4 布鲁氏菌与细胞自噬
3 布鲁氏菌免疫机制
4 PI3K/AKT信号转导通路
第二章 实验部分
实验一 布鲁氏菌对PI3K/AKT信号通路的激活
摘要
1 材料与方法
2 结果
2.1 羊种布鲁氏菌 16M对PI3K/Akt信号通路的激活
2.2 不同MOI的 16M对PI3K/Akt信号通路的激活
2.3 粗糙型和光滑型菌株对PI3K/Akt信号通路的激活
2.4 粗糙型和光滑型菌株的LPS对PI3K/Akt信号通路的激活
2.5 抑制剂LY对 16M介导的PI3K/Akt信号通路的阻断
2.6 抑制剂LY对巨噬细胞活性的影响
3 讨论
3.1 PI3K/Akt信号通路与疾病的关系
3.2 布鲁氏菌对PI3K/Akt信号通路的激活
3.3 脂多糖在激活PI3K/Akt信号通路中的作用
3.4 外膜蛋白对PI3K/Akt信号通路的激活
实验二 阻断PI3K/AKT信号通路对羊种布鲁氏菌 16M存活的影响
摘要
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 阻断PI3K/Akt信号通路抑制 16M的内化
2.2 阻断PI3K/Akt信号通路抑制 16M的胞内繁殖
2.3 阻断PI3K/Akt信号通路诱导 16M介导的IFN-γ、IL-12p70 和TNF-α的产生
2.4 LY在小鼠体内阻断 16M介导的PI3K/Akt信号通路
2.5 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M介导的小鼠产生的细胞因子的影响
2.6 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M介导的小鼠体内细胞亚群CD4+T和CD8+T细胞的影响
2.8 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M导致的小鼠内脏病理变化的影响
2.9 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M在小鼠体内存活的影响
2.10 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M导致的小鼠致死率的影响
3 讨论
3.1 细胞因子与布鲁氏菌感染
3.2 CD4~+和CD8~+T细胞与布鲁氏菌感染
3.3 布鲁氏菌导致机体的病理变化
实验三 阻断PI3K/AKT信号通路对羊种布鲁氏菌 16M介导细胞凋亡的影响
摘要
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M介导caspase-3、caspase-8 和caspase-9 活性的影响
2.2 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M介导凋亡相关基因的影响
2.3 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M介导凋亡相关蛋白的影响
2.4 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M介导细胞凋亡率的影响
2.5 抑制剂Z-DEVD-fmk、Z-IETD-fmk、Z-LEHD-fmk和LY对细胞活性的影响。
2.6 Z-DEVD-fmk和Z-LEHD-fmk对 16M介导的caspase-3 和caspase-9 活性的影响
2.8 抑制剂Z-DEVD-fmk、Z-IETD-fmk、Z-LEHD-fmk对LY诱导 16M介导的细胞凋亡率的影响
2.9 抑制caspase-3 或caspase-9 活性对 16M介导的p-Akt(S473)表达的影响
3 讨论
3.1 病原菌与细胞凋亡
3.2 Akt与细胞凋亡
3.3 PARP与细胞凋亡
3.4 Caspase途径与细胞凋亡
实验四 阻断PI3K/AKT信号通路对羊种布鲁氏菌 16M介导细胞自噬的影响
摘要
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 Plex-MSC-EGFP-LC3 质粒的酶切验证
2.2 慢病毒的包装及转染效果观察
2.3 阻断PI3K/Akt信号通路对 16M诱导的细胞中GFP-LC3 阳性点数的影响
2.4 阻断PI3K/Akt信号通路对自噬相关基因mRNA水平的影响
2.5 阻断PI3K/Akt信号通路对自噬相关基因蛋白水平的影响
2.6 阻断PI3K/Akt信号通路对LysoTracker和LC3 共定位的影响
2.7 阻断PI3K/Akt信号通路对细胞中的自噬泡影响
3 讨论
3.1 细胞自噬利于布鲁氏菌的存活
3.2 LC3 蛋白与细胞自噬
3.3 自噬溶酶体途径与布鲁氏感染
3.4 PI3K/Akt信号通路与细胞自噬
实验五 PI3K催化亚基P110Α在羊种布鲁氏菌 16M侵染巨噬细胞过程中的功能
摘要
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 pLentiLox-siRNA载体的构建
2.2 慢病毒干扰载体的包装及转染效果观察
2.3 实时荧光定量PCR检测干扰片段抑制效果
2.4 沉默p110α基因对巨噬细胞活性的影响
2.5 沉默p110α基因对 16M激活PI3K/Akt信号通路的影响
2.6 沉默p110α基因对 16M在巨噬细胞中内化的影响
2.7 沉默p110α基因对 16M在巨噬细胞内存活的影响
2.8 沉默p110α基因对 16M介导的凋亡相关基因的影响
2.9 沉默p110α基因对 16M介导的细胞凋亡率的影响
2.10 沉默p110α基因对 16M自噬相关基因表达的影响
2.11 沉默p110α基因对 16M凋亡和自噬相关蛋白表达的影响
3 讨论
3.1 RNA干扰机制
3.2 RNA干扰慢病毒载体的优点
3.3 PI3K亚单位结构
3.4 P13Kp110α的功能
全文结论
创新点
参考文献
致谢
个人简介
附件
【参考文献】:
期刊论文
[1]伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡机制的探讨[J]. 刘婷婷,马丽娜,李凤云,刘勇,樊蓉. 中国人兽共患病学报. 2010(03)
[2]布鲁氏菌病的流行、发病原因及防治进展[J]. 周艳彬,柳晓琳. 辽宁医学院学报. 2010(01)
[3]布鲁氏菌病的研究与防控进展[J]. 任洪林,卢士英,周玉,李兆辉,柳增善. 中国畜牧兽医. 2009(09)
[4]中国布鲁氏菌病疫情监测与控制[J]. 崔步云. 疾病监测. 2007(10)
[5]PI3K在BCR/ABL阳性细胞中促进细胞周期进程和抗凋亡的作用[J]. 彭辉,冯文莉. 国外医学(临床生物化学与检验学分册). 2005(10)
[6]Huntingtin processing in pathogenesis of Huntington disease[J]. Zheng-hong QIN, Zhen-lun GUDepartment of Pharmacology, Soochow University School of Medicine, Suzhou 215 007, China; Laboratory of Cellular Neurobiology, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, MA 02129, USA. Acta Pharmacologica Sinica. 2004(10)
[7]布鲁氏菌病感染与免疫研究近况(续前)[J]. 尚德秋. 中国地方病防治杂志. 2003(03)
本文编号:3485425
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