猪肌肉/肝脏特异性表达MyoD/BGL1载体构建及转基因小鼠的研究

发布时间：2021-11-10 09:25

　　本论文验证猪肌肉特异性基因CAPN3肝脏特异性基因TTR启动子的活性。采用猪肌肉特异性基因myf6的启动子与MyoD基因的CDS序列,构建在猪肌肉特异性高效表达MyoD的重组体；采用猪肝脏特异性基因TTR的启动子与BGL1基因的CDS序列,构建在猪肝脏特异性高效表达BGLl的重组体,之后通过显微注射制作转基因小鼠,为培育高产低耗转基因猪建立转基因模型。目前取得的主要研究成果：1)肌肉组织特异性表达基因CAPN3启动子的活性分析。在GeneBank数据库中筛选在猪肌肉组织特异性表达基因CAPN3及其DNA序列,取其翻译起始位点ATG上游2300bp为启动子序列作为研究对象,运用NNPP、 DNAman、ConSit进行序列的核心启动子区域、不同物种同源性、同源性最高的区域转录结合因子进行预测分析；据此,构建了8个缺失片段的荧光表达载体,分别转染C2C12、3T3、Hepal-6细胞,确定第3个缺失片段P3（-705-0）活性最高,并且具有较强的组织特异性。2)肝脏特异性表达基因TTR启动子的活性分析。在GeneBank数据库中筛选在猪肝脏特异性表达基因TTR,以翻译起始位点ATG上游25... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：107 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
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第一章 动物转基因研究进展
    1 前言
    2 动物转基因技术的发展概况
    3 转基因动物制备方法
        3.1 原核显微注射法
        3.2 逆转录病毒感染法
        3.3 胚胎干细胞介导法
        3.4 精子载体法
        3.5 体细胞核移植法
        3.6 性腺注射转基因法
        3.7 RNA干涉法
        3.8 基因打靶结合克隆法
    4 转基因动物的鉴定
        4.1 转基因整合检测
        4.2 转基因表达检测
    5 转基因技术在畜牧生产方面的应用
        5.1 提高生产性能
        5.2 抗逆新品种(系)的培育
    6 转基因技术对畜牧生产领域的发展前景
    7 目的与意义
第二章 肌肉和肝脏组织特异性启动子活性分析
    1 前言
    2 试验材料
        2.1 主要的仪器设备
        2.2 主要试剂和药品
        2.3 主要试剂的配制
        2.4 主要生物学软件
        2.5 载体和菌种
    3 试验方法和步骤
        3.1 猪CAPN3基因和TTR基因启动子的PCR扩增
        3.2 荧光检测载体制备及酶切鉴定
        3.3 启动子活性测定
    4 结果与分析
        4.1 猪CAPN3启动子的克隆及功能分析
        4.2 转染细胞荧光活性的检测
        4.3 猪TTR启动子的克隆及功能分析
        4.4 转染细胞双荧光素酶活性的检测
    5 讨论
第三章 肌肉和肝脏特异性表达外源基因载体的构建
    1 前言
    2 试验材料
        2.1 主要仪器设备
        2.2 试验试剂与试剂盒
        2.3 主要溶液配方
        2.4 菌种和质粒
    3 试验方法
        3.1 中间载体pMyoDEGFP-N1的构建与鉴定
        3.2 肌肉特异性表达载体pSV40-myf6-MyoDEGFP-N1的构建与鉴定
        3.3 中间载体pGL-BGLhis-control的构建与鉴定
        3.4 肝脏特异性表达载体pTTRs-BGLhis-control的构建与鉴定
        3.5 细胞的培养
        3.6 RT-PCR检测外源基因的转录
    4 结果与分析
        4.1 中间载体pMyoDEGFP-N1的构建与鉴定
        4.2 肌肉特异性表达载体pSV40-myf6-MyoDEGFP-N1的构建与鉴定
        4.3 中间载体pBGLhis-control的构建与鉴定
        4.4 肝脏特异性表达载体pTTRs-BGLhis-control的构建与鉴定
        4.5 pSV40-myf6-MyoDEGFP-N1载体转染C2C12 mRNA水平的检测
        4.6 pTTRs-BGLhis-control载体转染Hepal-6 mRNA水平检测
    5 讨论
第四章 肌肉特异表达外源基因转基因小鼠的制备与鉴定
    1 前言
    2 试验材料
        2.1 主要仪器设备
        2.2 试验试剂与试剂盒
        2.3 试验动物
    3 试验方法
        3.1 显微注射用DNA片段的制备及纯化
        3.2 转基因小鼠的鉴定
    4 试验结果
        4.1 显微注射用DNA片段的制备及纯化
        4.2 阳性转基因小鼠的获得
        4.3 转基因小鼠PCR检测
    5 讨论
第五章 结论
    1 本研究获得的结果
    2 下一步的研究内容
参考文献
附录1：pSV40-myf6-MyoDEGFP-N1载体的序列
附录2：pTTRs-BGLhis-control载体的序列
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]SV40增强子对奶牛β-酪蛋白启动子活性的影响[J]. 钟宇,邵正,江黎明.  中国细胞生物学学报. 2013(02)
[2]Plcd1转基因小鼠的制备[J]. 杨伟伟,殷筱舒,殷黎静,张艳丽,李高天,刘桂杰,俞利平,顾美儿,吴宝金.  杭州师范大学学报(自然科学版). 2013(01)
[3]A33启动子结肠癌特异性探究及SV40增强子对其转录活性影响[J]. 钟丹,郑水娣,谌贺宽子,袁素敬,章康健.  中国细胞生物学学报. 2011(11)
[4]异源基因α1,3半乳糖转移酶与增强型绿色荧光蛋白融合对荧光蛋白表达的影响[J]. 唐晶,谢柏臻,李鹏飞,姚琴,赵涣阁,卓慧钦,刘祖国,赵永祥.  中华细胞与干细胞杂志(电子版). 2011(02)
[5]H2-K/β2-m双转基因小鼠的制备及鉴定[J]. 杜明娥,邱玉华,魏婧,窦非.  东南大学学报(医学版). 2011(02)
[6]动物转基因技术研究现状与应用前景[J]. 张瑞杰,苗向阳.  中国细胞生物学学报. 2010(05)
[7]现代生物育种的前沿与未来[J]. 李宁.  中国家禽. 2010(18)
[8]植物组织特异性启动子的研究进展[J]. 糜赛男,曹明富.  生物学教学. 2010(07)
[9]转基因动物技术及其研究进展[J]. 谢莲萍.  畜牧与饲料科学. 2009(09)
[10]转基因小鼠在现代生命科学中的应用[J]. 原丽红,林本夫.  生物技术通报. 2009(S1)

博士论文
[1]人HT、DAF和CD59基因联合转基因小鼠的制备及其抗异种器官移植免疫排斥反应的研究[D]. 刘秉乾.天津医科大学 2006



本文编号：3487019