猪LIGHT和鳜鱼GILT的克隆表达及生物学性质的研究

发布时间：2021-11-14 06:53

　　LIGHT是肿瘤坏死因子超家族第14个成员,在活化树突细胞、共刺激T细胞以及诱导肿瘤细胞凋亡等方面有着重要作用。猪是既是重要的肉类来源,也是研究人类相关疾病的动物模型。所以本课题以猪作为研究对象,对猪LIGHT基因进行了克隆表达以及生物学性质鉴定。首先,我们分析了猪LIGHT的基因序列,与其他肿瘤坏死因子超家族成员一样,猪LIGHT也是典型的Ⅱ型跨膜蛋白,含有一个预测的跨膜区、一个金属酶切位点、两个保守的半胱氨酸残基以及一个TNF同源结构域。为了研究LIGHT与免疫系统的关系,我们融合了猪LIGHT的胞外段（psLIGHT）和Fc片段,构建了一个新的蛋白分子psLIGHT-Fc。大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的表达系统,以其低成本,高生产率,操作简单等优点而备受亲睐,所以我们设计带有限制性酶切位点的引物,通过Overlap-PCR方法获得psLIGHT-Fc基因,酶切后插入pET28a原核表达载体中,然后转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经Protein A亲和层析柱纯化得到约44.3KDa的psLIGHT-Fc蛋白,并且对其进行SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。p... 

【文章来源】：南京师范大学江苏省 211工程院校

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－】人ＬＩＧＨＴ基因的染色体定位及其ＤＮＡ分子结构（摘自Ｇｒａｎｇｅｒ，２００１）??

、黒色素瘤细胞系中，ＩＦＮ－Ｙ可诱导ＧＩＬＴ表达［４°］。在黑色素瘤细胞系中，ＩＦＮ－Ｙ诱导ＧＩＬＴ表达需要ＳＴＡＴ１的协助，因为ＳＴＡＴ１可启动子区的ＳＴＡＴ１结合区域的寡核苷酸上［４１］。??ＧＩＬＴ的生物学作用??１参与ＩＩ型ＭＨＣ抗原的呈递??ＧＩＬＴ的一个重要功能就是加强ＩＩ型ＭＨＣ抗原的呈递，它通过还原ＭＨＣＩＩ结合位点，从而促进抗原呈递。大多数抗原的呈递都需要Ｇ例如鸡蛋中的溶菌酶（ＨＥＬ）、黑色素细胞分化抗原、病毒包膜蛋Ｌ含有４个链内二硫键［４２］（如图所示），所以它是研究抗原呈递过程变的最佳模型。ＨＥＬ的７４－８８位氨基酸残基中含有２个半胱氨酸残基，氨酸残基参与二硫键的形成，有研究证据表明抗原表位的呈递需要的还原，而ＧＩＬＴ参与了该过程中的二硫键还原，暴露出Ｉ－Ａｂ抗原表

第四章猪ＬＩＧＨＴ的克隆表达及生物学性质的研究如下：??５＇－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣ?ＣＴＧＡＴＧＣＡＡＧＡＧＣＧＧＡ－３，?ｉＢａｍＨＤ??５＇－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴ?ＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＣＣ－３，?｛ＨｉｎｄＩＩＩ）??ＳＰ１斜体部分为ＢａｍＨ丨酶切位点，ＳＰ２斜体部分为Ｈｉｎｄ?１１丨酶切位点。??．?２?ＰＣＲ?反应??ｏｖｅｒ丨ａｐ?ＰＣＲ扩增ｐｓＬＩＧＨＴ－Ｆｃ基因??——Ｆｃｌ??


本文编号：3494165