PPARG基因对奶山羊乳腺脂肪酸代谢的调控作用研究
发布时间：2021-11-18 02:54
羊奶富含短、中链脂肪酸以及不饱和脂肪酸，能有效预防人类的某些代谢疾病，因而具有良好的保健功能。羊奶的独特有益脂肪酸的含量与其乳腺乳脂代谢密切相关，因此研究山羊乳腺组织的脂肪酸代谢机理，有助于提高乳品质。过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome Proliferator-activated Receptor gamma，PPARG）是目前发现在脂肪组织中调控脂肪酸代谢的核心转录因子，它调控脂肪酸代谢基因网络，影响脂滴的形成，是脂肪细胞脂肪酸沉积的决定因子。但目前对奶山羊泌乳过程中PPARG对乳腺脂肪酸代谢的调控研究却鲜有报道。本研究以萨能奶山羊不同生理时期乳腺组织为材料，进行转录组测序，探讨山羊乳腺组织的mRNA的表达情况。克隆PPARG的不同亚型，验证他们在乳腺组织中的表达情况。通过特异性激动剂激活，腺病毒介导的RNAi干扰，以及腺病毒介导的过表达技术研究PPARG基因在山羊乳腺上皮细胞中的功能。结果表明，PPARG能够广泛地调控乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢基因网络，改变细胞内脂肪酸的组成，是脂肪酸调控的重要因子。PPARG可能在山羊泌乳过程中发挥着重要的作用。本研究的主要结果如下...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：124 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 羊奶的成分及其营养价值概述
1.2 泌乳过程中脂肪酸代谢研究进展
1.2.1 乳腺细胞外源吸收脂肪酸
1.2.2 脂肪酸的活化与运输
1.2.3 脂肪酸的从头合成与去饱和化
1.2.4 甘油三酯的合成与乳脂滴的组装
1.2.5 SREBP 与乳腺脂肪酸代谢
1.3 PPAR 家族与脂肪酸代谢
1.3.1 PPAR 家族及其组织表达分布
1.3.2 PPAR 家族与其激动剂
1.3.3 PPARG 调控脂肪酸代谢
1.3.4 PPARG 与疾病
1.4 PPARG 在泌乳过程中的功能研究
1.5 本研究的目的与意义
第二章 山羊乳腺组织转录组测序与生物信息学分析
2.1 材料与方法
2.1.1 主要试剂和仪器
2.1.2 样品采集与 RNA 提取
2.1.3 mRNA 的纯化与处理
2.1.4 文库构建
2.1.5 上机测序
2.1.6 数据分析与序列组装
2.1.7 转录本的功能注释
2.1.8 基因表达丰度分析
2.2 结果
2.2.1 转录组 de novo 拼接结果
2.2.2 Unigene 长度和 GC 含量分析
2.2.3 Unigene 功能注释
2.2.4 GO 分类
2.2.5 KOG 分类
2.2.6 脂肪酸代谢过程中的几个关键因子
2.3. 讨论
2.3.1 转录组测序结果的质量
2.3.2 山羊乳腺组织中脂肪酸代谢相关基因
2.4 本章小结
第三章 PPARG 的克隆、生物信息学分析与组织表达
3.1 材料与方法
3.1.1 主要试剂
3.1.2 主要仪器
3.1.3 引物设计
3.1.4 山羊不同组织以及不同泌乳时期乳腺组织的采集
3.1.5 总 RNA 的提取与 cDNA 的合成
3.1.6 PPARG 的克隆与鉴定
3.1.7 PPARG 的生物信息学分析
3.1.8 荧光定量检测 PPARG
3.1.9 数据分析
3.2 结果
3.2.1 PPARG1 和 PPARG2 的克隆
3.2.2 同源性分析
3.2.3 结构预测与分析
3.2.4 组织表达分析
3.2.5 PPARG 在泌乳不同时期的表达差异
3.3 讨论
3.3.1 奶山羊 PPARG 基因的克隆
3.3.2 奶山羊 PPARG 基因的结构分析
3.3.3 PPARG 组织表达谱
3.4 本章小结
第四章 山羊乳腺上皮细胞中 PPARG 的活性检测
4.1 材料与方法
4.1.1 主要材料
4.1.2 主要仪器
4.1.3 PPRE 序列和定量引物的合成
4.1.4 载体构建
4.1.5 细胞培养与处理
4.1.6 RNA 的提取与荧光定量 PCR 检测
4.1.7 细胞转染与处理
4.1.8 荧光素酶检测
4.1.9 MTT 试验
4.1.10 细胞内脂肪酸的提取
4.1.11 脂肪酸的检测
4.1.12 数据分析
4.2 结果
4.2.1 pGL3-PPRE 载体的构建
4.2.2 PPRE 在山羊乳腺细胞中的活性分析
4.2.3 PPRE 在 MCF-7 细胞中的活性分析
4.2.4 罗格列酮影响乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢基因的表达
4.2.5 罗格列酮激活 PPARG 影响乳腺上皮细胞的增殖
4.2.6 罗格列酮激活 PPARG 对乳腺上皮细胞中脂肪酸组成的影响
4.3 讨论
4.3.1 PPARG 对 PPRE 荧光素酶活性的影响
4.3.2 罗格列酮激活 PPARG 对脂肪酸代谢相关基因的影响
4.3.3 罗格列酮激活 PPARG 对细胞内脂肪酸组成的影响
4.3.4 PPARG 与乳腺上皮细胞的增殖
4.4 小结
第五章 PPARG 基因的 RNA 干扰研究
5.1 材料与方法
5.1.1 主要仪器设备
5.1.2 主要试验材料
5.1.3 山羊 PPARG 基因的 shRNA 干扰序列的设计与合成
5.1.4 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体构建
5.1.5 pDsRed1-C1-PPARG 表达载体的构建
5.1.6 shRNA 有效序列的筛选
5.1.7 重组腺病毒载体的构建
5.1.8 腺病毒的包装、扩增与滴度测定
5.1.9 腺病毒感染乳腺上皮细胞最佳 MOI 的测定
5.1.10 PPARG 基因的 RNA 干扰效率检测
5.1.11 western blotting 试验
5.1.12 荧光定量 PCR
5.2 结果
5.2.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体的构建
5.2.2 pDsRed1-C1- PPARG 载体的构建
5.2.3 shRNA 有效干扰序列的筛选
5.2.4 重组腺病毒载体的构建
5.2.5 腺病毒的包装、扩增及滴度测定
5.2.6 最佳感染复数 MOI（Multiplicity Of Infection）的探索
5.2.7 PPARG 基因干扰效率的检测
5.2.8 PPARG 基因干扰对脂肪酸代谢相关基因的影响
5.3 讨论
5.3.1 腺病毒的包装
5.3.2 有效 shRNA 的筛选
5.3.3 干扰 PPARG 对脂肪酸代谢相关基因的影响
5.4 本章小结
第六章 PPARG1 的过表达研究
6.1 试验材料与方法
6.1.1 主要试验材料
6.1.2 主要试验仪器
6.1.3 重组腺病毒载体构建
6.1.4 超表达病毒 Ad-PPARG1 包装、扩增
6.1.5 细胞培养与处理
6.1.6 总 RNA 的提取与荧光定量
6.1.7 Western blotting
6.1.8 超表达效率检测
6.1.9 细胞内脂肪酸的提取
6.1.10 脂肪酸的检测
6.1.11 数据处理
6.1.12 超表达 PPARG1 对脂肪酸代谢影响网络图构建
6.2 试验结果
6.2.1 pAd-PPARG1 腺病毒载体的构建
6.2.2 pAd-PPARG1 腺病毒的包装与扩增
6.2.3 最佳感染复数 MOI（Multiplicity Of Infection）的探索
6.2.4 PPARG1 基因超表达效率的检测
6.2.5 过表达 PPARG1 影响脂肪酸代谢相关基因
6.2.6 过表达 PPARG1 对脂肪酸组成的影响
6.2.7 过表达 PPARG1 基因网络构建
6.3 讨论
6.3.1 PPARG1 对脂肪酸代谢的影响
6.3.2 脂肪酸代谢网络构建
6.3.3 PPARG1 对脂肪酸组成的影响
6.4 本章小结
第七章 PPARG2 的过表达研究
7.1 试验材料与方法
7.1.1 主要试验材料
7.1.2 主要试验仪器
7.1.3 重组腺病毒载体构建
7.1.4 超表达病毒 Ad-PPARG2 包装、扩增
7.1.5 细胞培养与处理
7.1.6 总 RNA 的提取与荧光定量
7.1.7 Western blotting
7.1.8 超表达效率检测
7.1.9 细胞内脂肪酸的提取
7.1.10 脂肪酸的检测
7.1.11 数据处理
7.1.12 超表达 PPARG1 对脂肪酸代谢影响网络图构建
7.2 试验结果
7.2.1 pAd-PPARG2 腺病毒载体的构建
7.2.2 pAd-PPARG2 腺病毒的包装与扩增
7.2.3 最佳感染复数 MOI（Multiplicity Of Infection）的探索
7.2.4 PPARG2 基因超表达效率的检测
7.2.5 过表达 PPARG2 影响脂肪酸代谢相关基因
7.2.6 过表达 PPARG2 对脂肪酸组成的影响
7.2.7 过表达 PPARG2 基因网络构建
7.3 讨论
7.3.1 病毒载体的高效构建
7.3.2 基因表达后的翻译调控
7.3.3 PPARG 与脂肪酸代谢网络
7.3.4 PPARG 与脂肪酸的去饱和化
7.4 本章小结
结论
本研究的创新点
存在问题及展望
参考文献
附录
缩略词（Abbreviation）
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]奶山羊SCD基因CDS区的克隆、序列分析及过表达[J]. 石恒波,罗军,朱越,王紫骞,赵旺生. 中国农业科学. 2012(24)
[2]西农萨能奶山羊甘油三酯水解酶基因（ATGL）的cDNA克隆与组织表达分析[J]. 滕炎玲,罗军,李君,赵旺生,王桢,王维,胡仕良. 农业生物技术学报. 2010(06)
[3]批量快速测定法测定标志基因为GFP的重组病毒滴度[J]. 江千里,王健民,温丽敏,江汕,周虹. 第二军医大学学报. 2002(09)
硕士论文
[1]西农萨能羊TIP47基因的克隆分析与RNA干扰研究[D]. 郝娟.西北农林科技大学 2011
本文编号：3502059
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：124 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 羊奶的成分及其营养价值概述
1.2 泌乳过程中脂肪酸代谢研究进展
1.2.1 乳腺细胞外源吸收脂肪酸
1.2.2 脂肪酸的活化与运输
1.2.3 脂肪酸的从头合成与去饱和化
1.2.4 甘油三酯的合成与乳脂滴的组装
1.2.5 SREBP 与乳腺脂肪酸代谢
1.3 PPAR 家族与脂肪酸代谢
1.3.1 PPAR 家族及其组织表达分布
1.3.2 PPAR 家族与其激动剂
1.3.3 PPARG 调控脂肪酸代谢
1.3.4 PPARG 与疾病
1.4 PPARG 在泌乳过程中的功能研究
1.5 本研究的目的与意义
第二章 山羊乳腺组织转录组测序与生物信息学分析
2.1 材料与方法
2.1.1 主要试剂和仪器
2.1.2 样品采集与 RNA 提取
2.1.3 mRNA 的纯化与处理
2.1.4 文库构建
2.1.5 上机测序
2.1.6 数据分析与序列组装
2.1.7 转录本的功能注释
2.1.8 基因表达丰度分析
2.2 结果
2.2.1 转录组 de novo 拼接结果
2.2.2 Unigene 长度和 GC 含量分析
2.2.3 Unigene 功能注释
2.2.4 GO 分类
2.2.5 KOG 分类
2.2.6 脂肪酸代谢过程中的几个关键因子
2.3. 讨论
2.3.1 转录组测序结果的质量
2.3.2 山羊乳腺组织中脂肪酸代谢相关基因
2.4 本章小结
第三章 PPARG 的克隆、生物信息学分析与组织表达
3.1 材料与方法
3.1.1 主要试剂
3.1.2 主要仪器
3.1.3 引物设计
3.1.4 山羊不同组织以及不同泌乳时期乳腺组织的采集
3.1.5 总 RNA 的提取与 cDNA 的合成
3.1.6 PPARG 的克隆与鉴定
3.1.7 PPARG 的生物信息学分析
3.1.8 荧光定量检测 PPARG
3.1.9 数据分析
3.2 结果
3.2.1 PPARG1 和 PPARG2 的克隆
3.2.2 同源性分析
3.2.3 结构预测与分析
3.2.4 组织表达分析
3.2.5 PPARG 在泌乳不同时期的表达差异
3.3 讨论
3.3.1 奶山羊 PPARG 基因的克隆
3.3.2 奶山羊 PPARG 基因的结构分析
3.3.3 PPARG 组织表达谱
3.4 本章小结
第四章 山羊乳腺上皮细胞中 PPARG 的活性检测
4.1 材料与方法
4.1.1 主要材料
4.1.2 主要仪器
4.1.3 PPRE 序列和定量引物的合成
4.1.4 载体构建
4.1.5 细胞培养与处理
4.1.6 RNA 的提取与荧光定量 PCR 检测
4.1.7 细胞转染与处理
4.1.8 荧光素酶检测
4.1.9 MTT 试验
4.1.10 细胞内脂肪酸的提取
4.1.11 脂肪酸的检测
4.1.12 数据分析
4.2 结果
4.2.1 pGL3-PPRE 载体的构建
4.2.2 PPRE 在山羊乳腺细胞中的活性分析
4.2.3 PPRE 在 MCF-7 细胞中的活性分析
4.2.4 罗格列酮影响乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢基因的表达
4.2.5 罗格列酮激活 PPARG 影响乳腺上皮细胞的增殖
4.2.6 罗格列酮激活 PPARG 对乳腺上皮细胞中脂肪酸组成的影响
4.3 讨论
4.3.1 PPARG 对 PPRE 荧光素酶活性的影响
4.3.2 罗格列酮激活 PPARG 对脂肪酸代谢相关基因的影响
4.3.3 罗格列酮激活 PPARG 对细胞内脂肪酸组成的影响
4.3.4 PPARG 与乳腺上皮细胞的增殖
4.4 小结
第五章 PPARG 基因的 RNA 干扰研究
5.1 材料与方法
5.1.1 主要仪器设备
5.1.2 主要试验材料
5.1.3 山羊 PPARG 基因的 shRNA 干扰序列的设计与合成
5.1.4 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体构建
5.1.5 pDsRed1-C1-PPARG 表达载体的构建
5.1.6 shRNA 有效序列的筛选
5.1.7 重组腺病毒载体的构建
5.1.8 腺病毒的包装、扩增与滴度测定
5.1.9 腺病毒感染乳腺上皮细胞最佳 MOI 的测定
5.1.10 PPARG 基因的 RNA 干扰效率检测
5.1.11 western blotting 试验
5.1.12 荧光定量 PCR
5.2 结果
5.2.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体的构建
5.2.2 pDsRed1-C1- PPARG 载体的构建
5.2.3 shRNA 有效干扰序列的筛选
5.2.4 重组腺病毒载体的构建
5.2.5 腺病毒的包装、扩增及滴度测定
5.2.6 最佳感染复数 MOI（Multiplicity Of Infection）的探索
5.2.7 PPARG 基因干扰效率的检测
5.2.8 PPARG 基因干扰对脂肪酸代谢相关基因的影响
5.3 讨论
5.3.1 腺病毒的包装
5.3.2 有效 shRNA 的筛选
5.3.3 干扰 PPARG 对脂肪酸代谢相关基因的影响
5.4 本章小结
第六章 PPARG1 的过表达研究
6.1 试验材料与方法
6.1.1 主要试验材料
6.1.2 主要试验仪器
6.1.3 重组腺病毒载体构建
6.1.4 超表达病毒 Ad-PPARG1 包装、扩增
6.1.5 细胞培养与处理
6.1.6 总 RNA 的提取与荧光定量
6.1.7 Western blotting
6.1.8 超表达效率检测
6.1.9 细胞内脂肪酸的提取
6.1.10 脂肪酸的检测
6.1.11 数据处理
6.1.12 超表达 PPARG1 对脂肪酸代谢影响网络图构建
6.2 试验结果
6.2.1 pAd-PPARG1 腺病毒载体的构建
6.2.2 pAd-PPARG1 腺病毒的包装与扩增
6.2.3 最佳感染复数 MOI（Multiplicity Of Infection）的探索
6.2.4 PPARG1 基因超表达效率的检测
6.2.5 过表达 PPARG1 影响脂肪酸代谢相关基因
6.2.6 过表达 PPARG1 对脂肪酸组成的影响
6.2.7 过表达 PPARG1 基因网络构建
6.3 讨论
6.3.1 PPARG1 对脂肪酸代谢的影响
6.3.2 脂肪酸代谢网络构建
6.3.3 PPARG1 对脂肪酸组成的影响
6.4 本章小结
第七章 PPARG2 的过表达研究
7.1 试验材料与方法
7.1.1 主要试验材料
7.1.2 主要试验仪器
7.1.3 重组腺病毒载体构建
7.1.4 超表达病毒 Ad-PPARG2 包装、扩增
7.1.5 细胞培养与处理
7.1.6 总 RNA 的提取与荧光定量
7.1.7 Western blotting
7.1.8 超表达效率检测
7.1.9 细胞内脂肪酸的提取
7.1.10 脂肪酸的检测
7.1.11 数据处理
7.1.12 超表达 PPARG1 对脂肪酸代谢影响网络图构建
7.2 试验结果
7.2.1 pAd-PPARG2 腺病毒载体的构建
7.2.2 pAd-PPARG2 腺病毒的包装与扩增
7.2.3 最佳感染复数 MOI（Multiplicity Of Infection）的探索
7.2.4 PPARG2 基因超表达效率的检测
7.2.5 过表达 PPARG2 影响脂肪酸代谢相关基因
7.2.6 过表达 PPARG2 对脂肪酸组成的影响
7.2.7 过表达 PPARG2 基因网络构建
7.3 讨论
7.3.1 病毒载体的高效构建
7.3.2 基因表达后的翻译调控
7.3.3 PPARG 与脂肪酸代谢网络
7.3.4 PPARG 与脂肪酸的去饱和化
7.4 本章小结
结论
本研究的创新点
存在问题及展望
参考文献
附录
缩略词（Abbreviation）
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]奶山羊SCD基因CDS区的克隆、序列分析及过表达[J]. 石恒波,罗军,朱越,王紫骞,赵旺生. 中国农业科学. 2012(24)
[2]西农萨能奶山羊甘油三酯水解酶基因（ATGL）的cDNA克隆与组织表达分析[J]. 滕炎玲,罗军,李君,赵旺生,王桢,王维,胡仕良. 农业生物技术学报. 2010(06)
[3]批量快速测定法测定标志基因为GFP的重组病毒滴度[J]. 江千里,王健民,温丽敏,江汕,周虹. 第二军医大学学报. 2002(09)
硕士论文
[1]西农萨能羊TIP47基因的克隆分析与RNA干扰研究[D]. 郝娟.西北农林科技大学 2011
本文编号：3502059
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3502059.html
