基于甲基化与lncRNA的绒山羊毛囊发育表观遗传学初步研究

发布时间：2017-05-08 12:01

  本文关键词：基于甲基化与lncRNA的绒山羊毛囊发育表观遗传学初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：羊绒(Cashmere)是由山羊皮肤次级毛囊产生的无髓纤维,生长在山羊外表皮层。由于其纤维具有轻、柔、暖等特点,有“纤维宝石”和“软黄金”之誉,在畜牧业生产中具有重要的经济价值。皮肤毛囊的发育直接影响山羊绒的产量和品质,因此研究绒山羊毛囊发育的调控机制,对于提高羊绒的产量和品质(细度和长度)具有重要的意义,也是当前绒山羊育种工作中非常重要的内容。羊绒的生长具有明显的周期性变化,多种调控因子参与了这一过程,包括编码RNA和非编码RNA。长链非编码RNA(long-noncoding RNAs,lncRNAs)是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200 nt的RNA分子,在很多生物过程中发挥重要的作用。前期对羊绒生长期和休止期皮肤组织的RNA-seq测序结果表明,差异表达的lnc15479与毛囊发育相关基因Hox、KAPs、Wnt2、FGF5以及BMPs等有关。因此,为了从不同的角度揭示羊绒周期性生长的分子机制,本研究对陕北白绒山羊在羊绒生长期和休止期皮肤组织中Hoxc13、Msx-2和FGF5的甲基化程度进行分析,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定Hoxc13基因和DNA甲基转移酶相关基因(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)在羊绒生长期和休止期皮肤组织中的相对表达量。同时利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立了lnc15479的敲除系统,为后续研究lnc15479的功能及作用机制提供技术支持。主要获得了如下结果:(1)DNA甲基化分析结果表明:Hoxc13基因启动子区的一个CpG位点的甲基化程度在羊绒休止期显著高于生长期(P0.05),而Msx-2基因启动子区和FGF5基因外显子1的甲基化状态在羊绒生长期和休止期没有显著变化。(2)qRT-PCR结果表明:Hoxc13基因在羊绒生长期的基因表达水平极显著高于羊绒休止期(P0.01)。而DNA甲基转移酶相关基因DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在羊绒休止期的相对表达量都极显著高于羊绒生长期的表达量(P0.01);在同一生长时期,DNMTs基因间的表达量没有显著差异。DNMTs基因在羊绒休止期和生长期的表达量的变化趋势与Hoxc13基因在羊绒休止期和生长期甲基化程度变化趋势相似。因此推测,DNMTs通过调节Hoxc13基因的甲基化水平对羊绒的周期性生长具有调控作用。(3)通过在lnc15479的上、下游各设计一个sgRNA靶位点,构建CRISPR/Cas9表达载体,并基于SSA修复机制,分别构建了含有红色荧光和绿色荧光的双荧光报告载体系统。通过将表达载体和报告载体共转染HEK293T细胞来检测该CRISPR/Cas9系统的工作效率。结果表明,lnc15479的CRISPR/Cas9系统表达载体成功构建,根据红色荧光和绿色荧光的表达情况及细胞计数的方法,该系统的工作效率约为20%~30%。研究结果为进一步研究lnc15479的功能及调控机制提供技术支持。
【关键词】：Hoxc13 甲基化 CRISPR/Cas9 lncRNA 绒山羊
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 文献综述13-20
• 1.1 陕北白绒山羊简介13
• 1.2 毛囊发育相关基因的国内外研究概况13-15
• 1.2.1 Hox基因13-15
• 1.2.2 Msx-2 对毛囊发育的影响15
• 1.2.3 FGF5对毛囊发育的影响15
• 1.3 甲基化概述15-17
• 1.3.1 甲基转移酶基因简介15
• 1.3.2 DNA甲基化15-16
• 1.3.3 DNA甲基化的功能及调控机制16
• 1.3.4 Sequenom MassARRAY?甲基化检测技术16
• 1.3.5 BSP甲基化检测技术16-17
• 1.4 lncRNAs17-18
• 1.4.1 lncRNAs简介17
• 1.4.2 lncRNAs的研究进展17-18
• 1.5 CRISPR/Cas9核酸酶技术18-19
• 1.5.1 CRISPR/Cas9核酸酶技术的由来18
• 1.5.2 CRISPR/Cas9核酸酶技术的优缺点18-19
• 1.5.4 CRISPR/Cas9核酸酶技术的研究进展19
• 1.6 研究的目的与意义19-20
• 第二章 毛囊发育相关基因的甲基化研究20-29
• 2.1 材料与方法20-24
• 2.1.1 实验动物选择与组织样采集20
• 2.1.2 主要试剂及仪器20
• 2.1.3 DNA提取及质量检测20
• 2.1.4 Hoxc13基因甲基化检测试验过程20-23
• 2.1.5 Msx-2、FGF5基因甲基化检测试验过程23
• 2.1.6 数据统计分析23-24
• 2.2 结果与分析24-27
• 2.2.1 DNA质量检测分析24
• 2.2.2 PCR扩增结果24-25
• 2.2.3 Hoxc13基因甲基化差异的关联分析25-26
• 2.2.4 Msx-2 基因甲基化差异的关联分析26-27
• 2.2.5 FGF5基因甲基化差异的关联分析27
• 2.3 讨论27-28
• 2.4 小结28-29
• 第三章 DNMTs、Hoxc13基因在羊绒生长期和休止期的表达分析29-38
• 3.1 实验材料与方法29-32
• 3.1.1 试验动物与皮肤样品采集29
• 3.1.2 主要试剂及仪器（见附录）29
• 3.1.3 RNA提取的准备（见附录）29
• 3.1.4 引物的设计29-30
• 3.1.5 总RNA的提取30
• 3.1.6 RNA质量与浓度检测30
• 3.1.7 反转录及qRT-PCR30-31
• 3.1.8 数据统计分析31-32
• 3.2 结果与分析32-36
• 3.2.1 RNA质量检测分析32
• 3.2.2 qRT-PCR扩增体系检测结果32-33
• 3.2.3 羊绒生长期与休止期DNMTs基因平均相对表达量33-34
• 3.2.4 羊绒生长期和休止期Hoxc13基因平均相对表达量34-35
• 3.2.5 羊绒生长期DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因的表达量35
• 3.2.6 羊绒休止期DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因的表达量35-36
• 3.3 讨论36-37
• 3.4 小结37-38
• 第四章 靶向敲除绒山羊lnc15479的CRISPR/Cas9构建及活性验证38-47
• 4.1 材料38-39
• 4.1.1 细胞株和质粒38-39
• 4.1.2 实验材料和试剂39
• 4.1.3 主要仪器39
• 4.1.4 引物合成和测序39
• 4.2 方法39-43
• 4.2.1 构建表达载体msgRNA-239-41
• 4.2.2 构建双荧光报告载体41-43
• 4.2.3 在HEK293T细胞中检测CRISPR/Cas9活性43
• 4.3 结果43-45
• 4.3.1 CRISPR/Cas9真核表达载体及报告载体构建结果43-44
• 4.3.2 CRISPR/Cas9在哺乳细胞中的活性检测44-45
• 4.4 讨论45-46
• 4.5 小结46-47
• 第五章 结论与展望47-48
• 5.1 主要结论47
• 5.2 主要创新点47
• 5.3 需要进一步研究的问题47-48
• 参考文献48-57
• 附录57-73
• 致谢73-74
• 作者简介74

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