大熊猫犬瘟热和小熊猫犬细小病毒病病原调查及犬细小病毒免疫血清与疫苗的研制

发布时间：2017-05-07 17:08

  本文关键词：大熊猫犬瘟热和小熊猫犬细小病毒病病原调查及犬细小病毒免疫血清与疫苗的研制，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一种急性、高度接触性传染病,临床上以厌食、双相热、结膜炎、严重胃肠炎和神经症状为主要典型特征。犬细小病毒病(canine parvovirus,CP)是由犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)引起的一种急性、出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征的传染病。CDV和CPV的易感宿主范围不断扩大,可在大量物种间进行种内和种间传播。近些年来,大熊猫感染CDV和小熊猫感染CPV均有报道。目前尚无针对大熊猫和小熊猫的特异性免疫CDV血清、免疫CPV血清,以及相应的疫苗。本研究采用PCR检测和基因序列测定、细胞培养试验、病毒回归动物试验、病毒灭活试验、免疫接种、中和试验等方法,调查了陕西楼观台大熊猫繁育基地大熊猫犬瘟热和福州熊猫世界小熊猫犬细小病毒病的流行现状,对导致楼观台大熊猫死亡的犬瘟热病毒和导致福州熊猫世界小熊猫死亡的犬细小病毒进行分离鉴定、犬细小病毒灭活疫苗研制及免疫效果评估。研究获得如下结果:1.陕西楼观台大熊猫CDV抗凝血检出率为16%,棉拭子检出率为28%;采集陕西楼观台犬瘟热死亡大熊猫的心脏、肺、肝病料,预处理后接种Vero细胞,盲传到第5代时,vero细胞出现圆缩、聚集、脱落等病变;PCR扩增CDV N蛋白基因,得到一个287bp扩增片段,测序结果显示其与已发表的CDV山东毒株(亚洲-I型)的相似性为98%;细胞培养试验测得该毒株的TCID50为10-5.2/mL;幼犬感染该毒株后,出现体温升高、鼻头发干、拉稀、眼鼻分泌出水样分泌物等症状。证明成功分离到导致楼观台大熊猫死亡的犬瘟热病毒株,命名为LG株。2.福州熊猫世界小熊猫外周血中CPV检出率为10.0%,棉试子中CPV检出率为10%。导致小熊猫死亡的CPV阳性样品经过处理后接种到F81细胞上,盲传到第5代时细胞产生病变(CPE)明显,病变细胞出现拉网、圆缩、崩解、脱落。PCR扩增VP2基因,得到一个452 bp目的片段。测序结果显示其与CPV-北京毒株的同源性为100%。表明导致小熊猫死亡的CPV毒株分离成功,命名为CPV FZ株。3.细胞培养扩增CPV毒株,测定病毒TCID50为10-5.6/50μL。甲醛灭活完全,灭活疫苗与筛选的转移因子铝胶盐佐剂混合灭活疫苗,免疫犬3次后获得免疫血清中和抗体能效价为1:28.6。免疫犬攻毒后未发病,其中和抗体效价为1:211。结论:成功分离出CDV强毒LG株和CPV强毒FZ株;建立了CPV的灭活疫苗制备方法及相应的免疫程序,免疫试验证明疫苗免疫效果良好;获得了相应的灭活疫苗和免疫血清。上述结果为大熊猫和小熊猫2种疫病的免疫防控提供了参考依据。
【关键词】：大熊猫 小熊猫 犬瘟热病毒 犬细小病毒
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.93
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 文献综述11-21
• 第一章 犬瘟热及犬细小病毒病研究进展11-21
• 1.1 犬瘟热研究进展11-16
• 1.1.1 流行病学11-12
• 1.1.2 病原学12-14
• 1.1.3 诊断及治疗14-15
• 1.1.4 预防15-16
• 1.2 犬细小病毒病研究进展16-19
• 1.2.1 流行病学16-17
• 1.2.2 病原学17-18
• 1.2.3 诊断及治疗18-19
• 1.2.4 预防19
• 1.3 本研究的目的及意义19-21
• 试验研究21-49
• 第二章 陕西楼观台大熊猫犬瘟热、福州熊猫世界小熊猫犬细小病毒病病原调查及病原的分离鉴定21-38
• 2.1 材料21-22
• 2.1.1 动物21
• 2.1.2 细胞株21
• 2.1.3 主要试剂21-22
• 2.1.4 主要仪器22
• 2.1.5 主要溶液及配方22
• 2.2 方法22-27
• 2.2.1 福州熊猫世界小熊猫犬细小病毒病、陕西楼观台大熊猫繁育基地大熊猫犬瘟热分子病原调查22-25
• 2.2.2 大熊猫源犬瘟热病毒（CDV）分离与鉴定25-26
• 2.2.3 小熊猫源犬细小病毒（CPV）分离与鉴定26-27
• 2.3 结果27-36
• 2.3.1 大熊猫犬瘟热分子病原调查结果27-30
• 2.3.2 大熊猫犬瘟热分离鉴定结果30-31
• 2.3.3 小熊猫犬细小病毒（CPV）分子病原调查结果31-34
• 2.3.4 小熊猫犬细小病毒VP2基因PCR测序结果34
• 2.3.5 小熊猫犬细小病毒分离鉴定结果34-36
• 2.4 讨论36-37
• 2.5 小结37-38
• 第三章 CPV疫苗研制及免疫效果评估38-49
• 3.1 材料38-39
• 3.1.1 材料38-39
• 3.2 方法39-41
• 3.2.1 犬细小病毒（CPV）细胞毒TCID_(50)测定39
• 3.2.2 犬细小病毒（CPV）细胞毒灭活39
• 3.2.3 犬细小病毒（CPV）细胞毒疫苗灭活效果检验39-40
• 3.2.4 犬细小病毒（CPV）细胞毒疫苗免疫效果评估40-41
• 3.2.5 犬细小病毒（CPV）高免血清制备41
• 3.3 结果41-47
• 3.3.1 CPV TCID_(50)测定结果41-42
• 3.3.2 CPV灭活效果检验42-44
• 3.3.3 CPV TCID_(50)测定验证结果44-45
• 3.3.4 中和试验结果45-47
• 3.3.5 抗CPV高免血清制备47
• 3.4 讨论47-48
• 3.5 小结48-49
• 结论49-50
• 参考文献50-55
• 致谢55-56
• 作者简介56

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