mda5基因功能失活的DF1细胞系的构建
发布时间：2021-11-25 03:36
禽流感作为重要的人畜共患病,一直以来对养殖业和公共卫生健康造成重大影响。H9N2禽流感病毒感染家禽后虽不会造成很高的死亡率,但被感染的鸡抵抗力降低,导致鸡对其他病原易感而引发二次感染,对家禽养殖业造成重大经济损失。当禽流感病毒感染哺乳动物时其体内的RIG-I和MDA5受体能识别病毒RNA产生天然免疫反应,天然免疫系统的激活会引起下游的信号通路产生级联反应,并释放干扰素（IFN）和多种炎性因子发挥抗病毒效应。有研究表明在鸡的体内缺乏RIG-I受体,但当鸡被禽流感病毒感染时鸡体内同样可产生抗病毒作用的IFN-I。在哺乳动物MDA5的研究中,发现MDA5在抗流感病毒感染过程中可发挥识别病毒RNA并诱导IFN应答的作用,虽鸡的体内存在MDA5受体,但其在抗流感病毒中的功能并不清楚。因此本研究拟通过CRISPR/Cas9技术构建DF1细胞mda5功能失活的细胞系,评价mda5对H9N2禽流感病毒诱导IFN-β及对病毒增殖的影响,为阐释禽流感诱导IFN信号通路及开发适合H9N2流感病毒疫苗株增殖细胞系奠定基础。本研究首先拟通过将既可表达Cas9蛋白又可直接转录sgRNA的质粒转染到细胞完成基因突变...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
DF1细胞转染效率的观察Fig.4-1ObservethetransfectionefficiencyofDF1cellsA:在荧光显微镜下观察荧光细胞比率；B:自然光下对应观察细胞状态
图 4-2 转染 PX459 质粒于 DF1 细胞构建表达 CRISPR/Cas9 系统的 DF1 细胞系Fig.4-2 Construction of DF1 cell line expressing CRISPR/Cas9 system by transfecting PX459plasmid in DF1 cellsA:DF1 细胞转染 PX459 质粒后加入嘌呤霉素筛选；B:未转染质粒的 DF1 细胞加入嘌呤霉素筛选图中标尺代表实际尺寸为 10μm4.2 慢病毒包装条件的确定DF1 细胞中直接转染 PX459 质粒未能成功构建表达 CRISPR/Cas9 系统的细胞系，因此后续拟运用慢病毒系统进行细胞系构建，由于本实验室前期并未开展慢病毒系统相关研究，因此首先开展确定慢病毒包装条件的试验。本研究选用带荧光标签质粒 PWPXL 作为慢病毒骨架质粒，将包装的荧光慢病毒感染细胞，通过感染细胞中荧光细胞比例来评价慢病毒包装效率。首先探究了在 293T 细胞（图 4-3 所示）、293A 细胞（图 4-4 所示）及 293FT 细胞（图 4-5 所示）中，不同包膜质粒对慢病毒包装效率的影响，将收获的慢病毒分别感染细胞，结果显示仅在 293FT 细胞中以
图 4-3 293T 细胞转染慢病毒质粒后观察荧光ig. 4-3Observe fluorescence after transfection of lentiviral plasmid in 29A、B、C、D 分别表示以不同包膜质粒包装慢病毒图中标尺代表实际尺寸为 10μm
【参考文献】：
期刊论文
[1]禽类高致病性禽流感的流行特点与防控[J]. 栾志松. 山东畜牧兽医. 2018(01)
[2]全球禽流感流行概况及研究现状[J]. 王峥,柯昌文. 华南预防医学. 2017(02)
[3]我国低致病性禽流感研究概况[J]. 黄建龙,朱春霞,刘道新. 动物医学进展. 2014(04)
[4]我国禽流感研究进展及成就[J]. 张毅,王幼明,王芳,王静静,毕玉海,尹燕博,丁家波. 微生物学通报. 2014(03)
本文编号：3517322
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
DF1细胞转染效率的观察Fig.4-1ObservethetransfectionefficiencyofDF1cellsA:在荧光显微镜下观察荧光细胞比率；B:自然光下对应观察细胞状态
图 4-2 转染 PX459 质粒于 DF1 细胞构建表达 CRISPR/Cas9 系统的 DF1 细胞系Fig.4-2 Construction of DF1 cell line expressing CRISPR/Cas9 system by transfecting PX459plasmid in DF1 cellsA:DF1 细胞转染 PX459 质粒后加入嘌呤霉素筛选；B:未转染质粒的 DF1 细胞加入嘌呤霉素筛选图中标尺代表实际尺寸为 10μm4.2 慢病毒包装条件的确定DF1 细胞中直接转染 PX459 质粒未能成功构建表达 CRISPR/Cas9 系统的细胞系，因此后续拟运用慢病毒系统进行细胞系构建，由于本实验室前期并未开展慢病毒系统相关研究，因此首先开展确定慢病毒包装条件的试验。本研究选用带荧光标签质粒 PWPXL 作为慢病毒骨架质粒，将包装的荧光慢病毒感染细胞，通过感染细胞中荧光细胞比例来评价慢病毒包装效率。首先探究了在 293T 细胞（图 4-3 所示）、293A 细胞（图 4-4 所示）及 293FT 细胞（图 4-5 所示）中，不同包膜质粒对慢病毒包装效率的影响，将收获的慢病毒分别感染细胞，结果显示仅在 293FT 细胞中以
图 4-3 293T 细胞转染慢病毒质粒后观察荧光ig. 4-3Observe fluorescence after transfection of lentiviral plasmid in 29A、B、C、D 分别表示以不同包膜质粒包装慢病毒图中标尺代表实际尺寸为 10μm
【参考文献】：
期刊论文
[1]禽类高致病性禽流感的流行特点与防控[J]. 栾志松. 山东畜牧兽医. 2018(01)
[2]全球禽流感流行概况及研究现状[J]. 王峥,柯昌文. 华南预防医学. 2017(02)
[3]我国低致病性禽流感研究概况[J]. 黄建龙,朱春霞,刘道新. 动物医学进展. 2014(04)
[4]我国禽流感研究进展及成就[J]. 张毅,王幼明,王芳,王静静,毕玉海,尹燕博,丁家波. 微生物学通报. 2014(03)
本文编号：3517322
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