猪扁桃体上皮细胞系的建立及病毒易感性分析
发布时间：2021-11-27 02:09
日本脑炎（Japanese encephalitis,JE）是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一种重要的人畜共患传染病,在全世界范围内引起严重的危害,每年造成大约6-8万人感染,大约1.5-2万人死亡。猪-蚊-猪循环是乙脑传播的主要方式,猪是中间宿主和扩增宿主。乙脑感染猪时可引起母猪流产、木乃伊胎和公猪睾丸炎等,并在扁桃体中长期带毒。猪作为JEV的扩增宿主,能够长时间产生病毒血症,是病毒传播和流行的基础。但目前猪作为储存宿主的原因仍然未知。扁桃体是猪在感染乙脑时关键的带毒器官,能够长期携带病毒,可能与猪持续产生病毒血症有关。同时,猪扁桃体也是多种猪病原体的携带器官,多种重要的猪病原体可长期存在于扁桃体中,然而由于缺少猪源扁桃体细胞系阻碍了相关研究的开展。本实验构建了一种猪扁桃体传代细胞系（Pig tonsil cell,PT）,分析了该细胞系对猪主要病原体的易感性。发现PT细胞可以对JEV和猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）易感。然后分析了JEV对PT细胞的感染过程,发现PT细胞在病毒受体和...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
猪软腭扁桃体的组织学切片
中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论4图1-2JEV的基因组结构和基因表达Fig.1-2JEVgenomeorganizationa.JEV基因组;b.基因表达;c.蛋白拓扑结构a.Genomeorganization;b.Geneexpression;c.Polyproteinmembranetopology简单来说病毒的循环过程包括吸附，膜融合，脱衣壳，核酸复制和蛋白质合成，组装和释放(徐庆强等2013)。首先是病毒的糖蛋白E和细胞表面的一个或者多个附着因子结合(KONISHIetal.,1992)，然后病毒和附着因子相互作用，诱导触发受体介导的依赖网格蛋白和不依赖网格蛋白的病毒内吞作用(GUOetal.,2018)，进入内体后，经过低PH的诱导，E蛋白构象发生变化，触发病毒与和核内体膜融合，病毒RNA的基因组释放到细胞质中，完成脱衣壳(LIUetal.,2017)。随后被转运到内质网中，翻译成两个多聚蛋白，多聚蛋白被相应的蛋白酶切割成结构蛋白和非结构蛋白。病毒的非结构蛋白和细胞内的一些因子共同参与病毒基因组的复制，在内质网中形成复制复合体，完成负链RNA的合成，正链RNA的合成，封链。加帽等过程(NEYTSetal.,1999)。新合成的RNA与C蛋白在内质网中以出芽的方式形成未成熟的病毒粒子，就会结合细胞质中的PrM蛋白和E蛋白，在反式高尔基体转运的过程中，受到酸性环境的刺激，PrM蛋白构象发生改变从而暴露单边切割位点，被弗林蛋白酶切割成成熟的M蛋白，随后M蛋白和E单边发生重排，至此，成熟的病毒粒子就形成了。成熟的病毒粒子被分泌到细胞外，完成了病毒复制的过程。总的来说，病毒的复制发生在细胞质中。1.3.3致病性JEV具有神经嗜性，易造成严重的中枢神经系统疾病及其并发症。JEV在体内扩增后，可以经过血液循环，突破血脑屏障侵入中枢神经系统从而致病(MANSFIELDetal.,2017)。JEV也可对宿主的脑、心脏、肝脏、丘脑、胸腺等组织造成?
中国农业科学院硕士学位论文第二章猪扁桃体细胞系模型的建立1360℃30秒95℃15秒总共40个循环；总共1个循环。然后用函数公式计算GAPDH的CT值，并且计算出各样品基因与GAPDH的mRNA表达的相对含量及percentageGAPDH(%GAPDH)，分别为：2-ΔCT、100×2-ΔCT，其中ΔCT=(CT目的基因mRNA-CTGAPDHmRNA)。2.2.9猪扁桃体传代细胞系形态观察PT细胞消化后铺24孔板，每孔2×105个细胞，在最佳培养条件下培养24小时，48小时，72小时。在不同的时间点收获细胞，弃上清培养基，加入PBS冲洗3次，加入1mL的PBS在倒置显微镜下观察细胞形态和生长状况。2.3结果2.3.1传代细胞系的鉴定首先检测了细胞中是否含有支原体和细菌等污染，如图所示，A为检测细胞的污染物，泳道1为支原体检测，泳道2为细菌检测，泳道3和4为阴性对照，M1为DNA分子质量标准(DL2000)，结果检测均为阴性。说明细胞没有污染，状态良好。然后确定了正常细胞的嘌呤霉素最小致死浓度为2μg/μL，用这个浓度的嘌呤霉素对细胞系进行了筛选，筛选几代后开始进行细胞单克隆，将细胞无限稀释然后在96孔板中逐渐培养扩大，再次稀释培养扩大，经过三次克隆后就得到了一株比较纯正的猪扁桃体上皮细胞系，并且可以无限增殖，可以扩大培养30代以上，显微镜下观察到全部为角蛋白CK-19阳性的上皮细胞。图2-1细胞系鉴定Fig.2-1Identificationofcelllinesa.细胞污染检测;b.上皮细胞纯度检测a.Identificationofcellcontamination;b.Identificationofcellpurityab
本文编号：3521383
【文章来源】：中国农业科学院北京市
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猪软腭扁桃体的组织学切片
中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论4图1-2JEV的基因组结构和基因表达Fig.1-2JEVgenomeorganizationa.JEV基因组;b.基因表达;c.蛋白拓扑结构a.Genomeorganization;b.Geneexpression;c.Polyproteinmembranetopology简单来说病毒的循环过程包括吸附，膜融合，脱衣壳，核酸复制和蛋白质合成，组装和释放(徐庆强等2013)。首先是病毒的糖蛋白E和细胞表面的一个或者多个附着因子结合(KONISHIetal.,1992)，然后病毒和附着因子相互作用，诱导触发受体介导的依赖网格蛋白和不依赖网格蛋白的病毒内吞作用(GUOetal.,2018)，进入内体后，经过低PH的诱导，E蛋白构象发生变化，触发病毒与和核内体膜融合，病毒RNA的基因组释放到细胞质中，完成脱衣壳(LIUetal.,2017)。随后被转运到内质网中，翻译成两个多聚蛋白，多聚蛋白被相应的蛋白酶切割成结构蛋白和非结构蛋白。病毒的非结构蛋白和细胞内的一些因子共同参与病毒基因组的复制，在内质网中形成复制复合体，完成负链RNA的合成，正链RNA的合成，封链。加帽等过程(NEYTSetal.,1999)。新合成的RNA与C蛋白在内质网中以出芽的方式形成未成熟的病毒粒子，就会结合细胞质中的PrM蛋白和E蛋白，在反式高尔基体转运的过程中，受到酸性环境的刺激，PrM蛋白构象发生改变从而暴露单边切割位点，被弗林蛋白酶切割成成熟的M蛋白，随后M蛋白和E单边发生重排，至此，成熟的病毒粒子就形成了。成熟的病毒粒子被分泌到细胞外，完成了病毒复制的过程。总的来说，病毒的复制发生在细胞质中。1.3.3致病性JEV具有神经嗜性，易造成严重的中枢神经系统疾病及其并发症。JEV在体内扩增后，可以经过血液循环，突破血脑屏障侵入中枢神经系统从而致病(MANSFIELDetal.,2017)。JEV也可对宿主的脑、心脏、肝脏、丘脑、胸腺等组织造成?
中国农业科学院硕士学位论文第二章猪扁桃体细胞系模型的建立1360℃30秒95℃15秒总共40个循环；总共1个循环。然后用函数公式计算GAPDH的CT值，并且计算出各样品基因与GAPDH的mRNA表达的相对含量及percentageGAPDH(%GAPDH)，分别为：2-ΔCT、100×2-ΔCT，其中ΔCT=(CT目的基因mRNA-CTGAPDHmRNA)。2.2.9猪扁桃体传代细胞系形态观察PT细胞消化后铺24孔板，每孔2×105个细胞，在最佳培养条件下培养24小时，48小时，72小时。在不同的时间点收获细胞，弃上清培养基，加入PBS冲洗3次，加入1mL的PBS在倒置显微镜下观察细胞形态和生长状况。2.3结果2.3.1传代细胞系的鉴定首先检测了细胞中是否含有支原体和细菌等污染，如图所示，A为检测细胞的污染物，泳道1为支原体检测，泳道2为细菌检测，泳道3和4为阴性对照，M1为DNA分子质量标准(DL2000)，结果检测均为阴性。说明细胞没有污染，状态良好。然后确定了正常细胞的嘌呤霉素最小致死浓度为2μg/μL，用这个浓度的嘌呤霉素对细胞系进行了筛选，筛选几代后开始进行细胞单克隆，将细胞无限稀释然后在96孔板中逐渐培养扩大，再次稀释培养扩大，经过三次克隆后就得到了一株比较纯正的猪扁桃体上皮细胞系，并且可以无限增殖，可以扩大培养30代以上，显微镜下观察到全部为角蛋白CK-19阳性的上皮细胞。图2-1细胞系鉴定Fig.2-1Identificationofcelllinesa.细胞污染检测;b.上皮细胞纯度检测a.Identificationofcellcontamination;b.Identificationofcellpurityab
本文编号：3521383
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