基于表位多肽PPRV H蛋白抗体检测方法的建立及P蛋白功能研究
发布时间：2021-11-27 09:56
小反刍兽疫病毒（PPRV）属于副黏病毒科麻疹病毒属,主要感染山羊和绵羊等小反刍动物,具有较高的发病率和死亡率,世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告的疾病,我国列为I类动物传染病。近年来小反刍兽疫在我国频频发生,对畜牧业的发展造成严重威胁,该病主要以免疫预防为主,因此准确检测免疫抗体对于防控该病非常重要。以筛选的PPRV H蛋白B细胞表位为基础,选择反应原性较好的4段抗原表位串联后合成作为包被抗原,建立针对H蛋白抗体的iELISA检测方法,并对相关条件进行优化。经优化后,多表位抗原肽的最佳包被浓度为1.5ⅹ10-6μg/孔,待检血清阴阳性临界稀释浓度为1:100,酶标二抗最佳稀释浓度为1:80000;对反应中各种缓冲液进行筛选:包被液为碳酸盐缓冲液;血清和二抗稀释液均为PBST溶液,封闭液为2%BSA溶液;本试验在阳性对照OD450≥0.5、阴性对照OD450<0.25的基础上,血清样品的判定标准为:OD450<?X+2S=0.25为阴性,OD450≥?X+3S...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
小反刍兽疫病毒基因组结构
中国农业科学院硕士学位论文第一章引言3图1-2小反刍兽疫病毒粒子结构Fig1-2ThestructureofPPRVparticle1.1.2病毒基因编码的蛋白及其功能1.1.2.1核衣壳（N）蛋白PPRV核衣壳蛋白是病毒进入宿主细胞后最先表达的蛋白，也是病毒最为主要的结构蛋白，其基因全长1577bp，编码525个氨基酸，蛋白分子量大约为58kDa。小反刍兽疫病毒N蛋白高度保守，其序列与麻疹病毒属其它成员具有较高的相似性，同源性在75-83%之间，根据这一点将N蛋白分为4个区段。区段I位于1-120氨基酸区段且高度保守；区段II位于122-145氨基酸区段，同源性仅40%；区段III位于146-398氨基酸处，为保守性最高的区段；区段IV位于421-525氨基酸处，为保守性最差的区段(Baileyetal.,2005;A.Diallo,Barrett,Barbron,Meyer,&Lefevre,1994)。相关研究显示，PPRVN蛋白I区和II区相对于III区和IV区具有相对较好的免疫原性，这与麻疹病毒成员中麻疹病毒和牛瘟病毒N蛋白相应区域的免疫原性一样(Choi,Nah,Ko,Kang,&Joo,2003;N,O,&L,1989)。N蛋白在病毒的生命周期中扮演着重要的作用。在病毒组装阶段，N蛋白可与病毒M蛋白相互作用从而促进病毒的组装；同时也是病毒基因组RNA形成核衣壳必不可少的成分，在病毒的复制和转录过程中参与到P-L聚合酶的形成。通过对病毒N基因进行沉默，可检测到病毒的复制减少，进一步的研究发现对N蛋白进行抑制后PPRVM蛋白的表达量减少(ServandeAlmeida,Keita,Libeau,&Albina,2007)，说明病毒N蛋白与病毒的复制密切相关。N蛋白虽然是病毒免疫原性最强且表达量最丰富的蛋白，但该蛋白并不能诱导机体产生免疫保护。由于N蛋白免疫原性最强，所以被广泛应用于PPRV诊断技术的开发。1.1.2.2磷酸化（P）蛋白
中国农业科学院硕士学位论文第一章引言7图1-3基于H基因的PPRV进化分析(Liangetal.,2016)Fig1-3ThephylogenticanalysisofPPRVbasedonHgene(Z.Liang,Yuan,Chen,Zhu,&Dou,2016)1.1.4PPRV的致病机制1.1.4.1PPRV诱导的细胞凋亡病毒进入细胞后具有阻止细胞凋亡的机制，也有促进细胞凋亡的机制。PPRV的感染周期较长，可达4-7天，病毒进入细胞后利用其抑制细胞凋亡的机制阻止细胞凋亡，从而延长病毒在胞内的持续增殖；当病毒粒子将要从胞内释放，病毒即启动促进细胞凋亡的机制，促进细胞凋亡裂解使病毒释放持续感染临近的细胞。诱导细胞凋亡的同时产生细胞毒性，由此产生致病性。PPRV感染山羊的外周血单淋巴细胞后，诱导的细胞凋亡可以促进病毒在细胞内的复制(Mondal,Sreenivasa,Dhar,Singh,&Bandyopadhyay,2001)。研究发现麻疹病毒的N蛋白为诱导凋亡的关键蛋白(Ashima,Jyoti,Akhil,Pramod,&J.,2011)，N蛋白在麻疹病毒属成员中相对保守且PPRVN蛋白与MV的N蛋白具有高度相似性，因此可以推测PPRV的N蛋白也可能具有MVN蛋白的相似功能。相关研究表明，PPRV感染后诱导的凋亡与PPRV和免疫系统之间的相互作用有关，虽然其机制尚不清楚，但这一现象已在MV上得到验证(Schnorr,Seufert,Schlender,Borst,&Schneider-Schaulies,1998)。1.1.4.2PPRV引起的免疫抑制
【参考文献】：
期刊论文
[1]Reverse Genetics for Peste des Petits Ruminants Virus: Current Status and Lessons to Learn from Other Non-segmented Negative-Sense RNA Viruses[J]. Alfred Niyokwishimira,Yongxi Dou,Bang Qian,Prajapati Meera,Zhidong Zhang. Virologica Sinica. 2018(06)
[2]小反刍兽疫病毒H蛋白的表达及间接ELISA方法的建立[J]. 栾志舫,陈妍,吴锦艳,王光祥,田宏,尹双辉,杨顺利,尚佑军,张志东,刘湘涛. 中国兽医学报. 2016(07)
[3]小反刍兽疫的流行动态及疫苗的研究进展[J]. 赵刚. 现代畜牧兽医. 2014(03)
[4]小反刍兽疫流行病学及防控研究进展[J]. 龙云凤,刘晓慧,周晓黎,祝贺,艾军,董俊,叶玲玲,陈朝银. 动物医学进展. 2012(05)
[5]小反刍兽疫的研究进展[J]. 骆学农,郑亚东,才学鹏. 中国兽医科学. 2007(11)
[6]临界值标准法应用于酶联免疫吸附检测结果判断的研究[J]. 梁棉. 现代医院. 2005(06)
硕士论文
[1]小反刍兽疫多表位疫苗抗原的设计及其免疫效力评价[D]. 梁忠祥.中国农业科学院 2017
[2]PPRV DAS-ELISA和胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立[D]. 何红菊.昆明理工大学 2013
本文编号：3522045
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
小反刍兽疫病毒基因组结构
中国农业科学院硕士学位论文第一章引言3图1-2小反刍兽疫病毒粒子结构Fig1-2ThestructureofPPRVparticle1.1.2病毒基因编码的蛋白及其功能1.1.2.1核衣壳（N）蛋白PPRV核衣壳蛋白是病毒进入宿主细胞后最先表达的蛋白，也是病毒最为主要的结构蛋白，其基因全长1577bp，编码525个氨基酸，蛋白分子量大约为58kDa。小反刍兽疫病毒N蛋白高度保守，其序列与麻疹病毒属其它成员具有较高的相似性，同源性在75-83%之间，根据这一点将N蛋白分为4个区段。区段I位于1-120氨基酸区段且高度保守；区段II位于122-145氨基酸区段，同源性仅40%；区段III位于146-398氨基酸处，为保守性最高的区段；区段IV位于421-525氨基酸处，为保守性最差的区段(Baileyetal.,2005;A.Diallo,Barrett,Barbron,Meyer,&Lefevre,1994)。相关研究显示，PPRVN蛋白I区和II区相对于III区和IV区具有相对较好的免疫原性，这与麻疹病毒成员中麻疹病毒和牛瘟病毒N蛋白相应区域的免疫原性一样(Choi,Nah,Ko,Kang,&Joo,2003;N,O,&L,1989)。N蛋白在病毒的生命周期中扮演着重要的作用。在病毒组装阶段，N蛋白可与病毒M蛋白相互作用从而促进病毒的组装；同时也是病毒基因组RNA形成核衣壳必不可少的成分，在病毒的复制和转录过程中参与到P-L聚合酶的形成。通过对病毒N基因进行沉默，可检测到病毒的复制减少，进一步的研究发现对N蛋白进行抑制后PPRVM蛋白的表达量减少(ServandeAlmeida,Keita,Libeau,&Albina,2007)，说明病毒N蛋白与病毒的复制密切相关。N蛋白虽然是病毒免疫原性最强且表达量最丰富的蛋白，但该蛋白并不能诱导机体产生免疫保护。由于N蛋白免疫原性最强，所以被广泛应用于PPRV诊断技术的开发。1.1.2.2磷酸化（P）蛋白
中国农业科学院硕士学位论文第一章引言7图1-3基于H基因的PPRV进化分析(Liangetal.,2016)Fig1-3ThephylogenticanalysisofPPRVbasedonHgene(Z.Liang,Yuan,Chen,Zhu,&Dou,2016)1.1.4PPRV的致病机制1.1.4.1PPRV诱导的细胞凋亡病毒进入细胞后具有阻止细胞凋亡的机制，也有促进细胞凋亡的机制。PPRV的感染周期较长，可达4-7天，病毒进入细胞后利用其抑制细胞凋亡的机制阻止细胞凋亡，从而延长病毒在胞内的持续增殖；当病毒粒子将要从胞内释放，病毒即启动促进细胞凋亡的机制，促进细胞凋亡裂解使病毒释放持续感染临近的细胞。诱导细胞凋亡的同时产生细胞毒性，由此产生致病性。PPRV感染山羊的外周血单淋巴细胞后，诱导的细胞凋亡可以促进病毒在细胞内的复制(Mondal,Sreenivasa,Dhar,Singh,&Bandyopadhyay,2001)。研究发现麻疹病毒的N蛋白为诱导凋亡的关键蛋白(Ashima,Jyoti,Akhil,Pramod,&J.,2011)，N蛋白在麻疹病毒属成员中相对保守且PPRVN蛋白与MV的N蛋白具有高度相似性，因此可以推测PPRV的N蛋白也可能具有MVN蛋白的相似功能。相关研究表明，PPRV感染后诱导的凋亡与PPRV和免疫系统之间的相互作用有关，虽然其机制尚不清楚，但这一现象已在MV上得到验证(Schnorr,Seufert,Schlender,Borst,&Schneider-Schaulies,1998)。1.1.4.2PPRV引起的免疫抑制
【参考文献】：
期刊论文
[1]Reverse Genetics for Peste des Petits Ruminants Virus: Current Status and Lessons to Learn from Other Non-segmented Negative-Sense RNA Viruses[J]. Alfred Niyokwishimira,Yongxi Dou,Bang Qian,Prajapati Meera,Zhidong Zhang. Virologica Sinica. 2018(06)
[2]小反刍兽疫病毒H蛋白的表达及间接ELISA方法的建立[J]. 栾志舫,陈妍,吴锦艳,王光祥,田宏,尹双辉,杨顺利,尚佑军,张志东,刘湘涛. 中国兽医学报. 2016(07)
[3]小反刍兽疫的流行动态及疫苗的研究进展[J]. 赵刚. 现代畜牧兽医. 2014(03)
[4]小反刍兽疫流行病学及防控研究进展[J]. 龙云凤,刘晓慧,周晓黎,祝贺,艾军,董俊,叶玲玲,陈朝银. 动物医学进展. 2012(05)
[5]小反刍兽疫的研究进展[J]. 骆学农,郑亚东,才学鹏. 中国兽医科学. 2007(11)
[6]临界值标准法应用于酶联免疫吸附检测结果判断的研究[J]. 梁棉. 现代医院. 2005(06)
硕士论文
[1]小反刍兽疫多表位疫苗抗原的设计及其免疫效力评价[D]. 梁忠祥.中国农业科学院 2017
[2]PPRV DAS-ELISA和胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立[D]. 何红菊.昆明理工大学 2013
本文编号：3522045
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