滑液支原体DnaK的原核表达及免疫原性分析和亚细胞定位
发布时间：2021-12-22 21:53
参照GenBank中滑液支原体（Mycoplasma synoviae,MS）WVU1853株dnaK基因序列（CP011096.1）设计并合成特异性引物,利用overlap PCR技术扩增获得MS dnaK基因,并将其克隆至pMD19-T载体,在序列分析的基础上将该基因克隆至pET-28a（+）质粒,构建原核表达载体pET-dnaK并转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后,进行SDS-PAGE分析。继而将纯化表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA、Western-blot和免疫荧光试验对MS DnaK的免疫原性及其在细胞内的分布进行分析。结果显示,MS dna K基因全长1 791 bp,编码596个氨基酸,重组蛋白rMSDnaK在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达,且其相对分子质量约为67 ku。间接ELISA和Western-blot结果表明,rMSDnaK具有良好的免疫原性,且MS DnaK在其胞浆和胞膜中均有分布,但在胞膜中含量较多,免疫荧光试验进一步证实DnaK在MS膜表面的分布。本研究结果为进一步研究MS ...
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(08)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
滑液支原体dnaK基因的扩增Figure1AmplificationofMSdnaKgene500bp250bp100bp
pET-dnaK的双酶切鉴定Figure3BamHⅠandXhoⅠendonucleasesdigestioniden-tificationofvectorpET-dnaK250bp
中国兽医科学第50卷图3pET-dnaK的双酶切鉴定Figure3BamHⅠandXhoⅠendonucleasesdigestioniden-tificationofvectorpET-dnaKM：DNA分子质量标准；1：pET-dnaK的双酶切产物。M：DL15000DNAMarker；1：ProductsfrompET-dnaKdigestedwithBamHⅠandXhoⅠ.图2dnaK基因的系统进化树Figure2PhylogenetictreeofdnaKgene图1滑液支原体dnaK基因的扩增Figure1AmplificationofMSdnaKgeneM：DNA分子质量标准；1：dnaK基因的PCR产物；2：阴性对照。M：DL2000DNAMarker；1：PCRproductofdnaKgene；2：Negativecontrol.清（1∶200稀释），37℃孵育2h，PBST洗涤3次，加入100LHRP标记的山羊抗兔（1∶8000稀释）IgG，37℃孵育1h，PBST洗涤3次后，毎孔加100LTMB显色液，室温避光显色，15min后加终止液终止反应，并于450nm处测定D值。试验设空白和阴性对照，重复3次取平均值。1.11免疫荧光试验取对数生长期的MS菌液1.5mL，4℃12000r/min离心10min收集菌体，PBS洗3次后，用200L重悬，取适量涂于盖玻片上，同时设立阴性对照组，自然风干后加固定液固定20min，PBST洗涤3次，置于含5％脱脂乳的培养皿中封闭1h，加入MS重组蛋白DnaK抗血清（1∶1000稀释），37℃孵育2h，PBST洗涤3次，加入FITC标记的山羊抗兔IgG（1∶200稀释），37℃避光孵育1h，PBST避光洗涤3次，封片并于荧光显微镜下观察。2结果2.1MSdnaK基因的扩增以MS榆中分离株基因组DNA为模板，利用overlapPCR扩增dnaK基因，经琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小为1791bp（图1），与预期片段大小一致。2.2MSdnaK基因的序列分析将测序获得的dnaK基因序列与GenBank中部分MSdnaK序列进行比对。结果表明，与MS不同分离株的dnaK基因序列同源性高达99.4％，而与鸡毒支原体、牛支原体之间的
【参考文献】：
期刊论文
[1]牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究[J]. 张锐,杨铭伟,任静静,朱玲,柳旭伟,剡根强. 中国畜牧兽医. 2018(07)
[2]羊种布氏杆菌M5-90 DnaK的原核表达及免疫保护性研究[J]. 张俊波,印双红,易继海,张红,方维焕,王嘉福,李志强,陈创夫. 中国兽医科学. 2018(08)
[3]滑液支原体WVU1853株免疫相关膜蛋白的初步分析[J]. 包世俊,丁小琴,邢小勇,伏小平,薛慧文,温峰琴. 畜牧兽医学报. 2017(02)
[4]鸡毒支原体热休克蛋白GrpE粘附特性的鉴定[J]. 周长平,陈莹,李媛,高利萍,王显兵,王莉莉,于艳超,辛九庆. 中国预防兽医学报. 2017(01)
[5]猪肺炎支原体168弱毒菌株P65-DnaKc融合蛋白的表达及免疫原性[J]. 刘思远,刘东,关婉怡,鞠建松,赵宝华. 中国兽医学报. 2015(09)
[6]志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70（DnaK）多克隆抗体的制备和鉴定[J]. 王羽,周围,廖翔,岳俊杰,宋婷,戴红梅,陈欣欣,梁龙,呼和巴特尔. 细胞与分子免疫学杂志. 2015(01)
[7]绵羊肺炎支原体DnaK B细胞抗原表位预测及其蛋白结构分析[J]. 王慧,罗成波,贺纛,孔令萍,周碧君,文明,程振涛,王开功. 生物技术通报. 2014(03)
[8]牛支原体膜蛋白6种提取方法的比较研究[J]. 陈忠琼,范媛,周蓓,蒋勇,张利,黎晓敏. 中国兽医学报. 2013(06)
[9]鸡毒支原体醛缩酶的原核表达及膜定位鉴定[J]. 何随彬,谭磊,包世俊,郭小琴,仇旭升,宋翠萍,费荣梅,丁铲. 中国兽医科学. 2013(01)
[10]猪肺炎支原体中国分离株热休克蛋白Hsp70（Dnak）的全基因克隆及C末端基因的表达与免疫活性分析[J]. 李媛,张建华,王亮,乔祖建,辛九庆. 中国预防兽医学报. 2008(03)
本文编号：3547163
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(08)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
滑液支原体dnaK基因的扩增Figure1AmplificationofMSdnaKgene500bp250bp100bp
pET-dnaK的双酶切鉴定Figure3BamHⅠandXhoⅠendonucleasesdigestioniden-tificationofvectorpET-dnaK250bp
中国兽医科学第50卷图3pET-dnaK的双酶切鉴定Figure3BamHⅠandXhoⅠendonucleasesdigestioniden-tificationofvectorpET-dnaKM：DNA分子质量标准；1：pET-dnaK的双酶切产物。M：DL15000DNAMarker；1：ProductsfrompET-dnaKdigestedwithBamHⅠandXhoⅠ.图2dnaK基因的系统进化树Figure2PhylogenetictreeofdnaKgene图1滑液支原体dnaK基因的扩增Figure1AmplificationofMSdnaKgeneM：DNA分子质量标准；1：dnaK基因的PCR产物；2：阴性对照。M：DL2000DNAMarker；1：PCRproductofdnaKgene；2：Negativecontrol.清（1∶200稀释），37℃孵育2h，PBST洗涤3次，加入100LHRP标记的山羊抗兔（1∶8000稀释）IgG，37℃孵育1h，PBST洗涤3次后，毎孔加100LTMB显色液，室温避光显色，15min后加终止液终止反应，并于450nm处测定D值。试验设空白和阴性对照，重复3次取平均值。1.11免疫荧光试验取对数生长期的MS菌液1.5mL，4℃12000r/min离心10min收集菌体，PBS洗3次后，用200L重悬，取适量涂于盖玻片上，同时设立阴性对照组，自然风干后加固定液固定20min，PBST洗涤3次，置于含5％脱脂乳的培养皿中封闭1h，加入MS重组蛋白DnaK抗血清（1∶1000稀释），37℃孵育2h，PBST洗涤3次，加入FITC标记的山羊抗兔IgG（1∶200稀释），37℃避光孵育1h，PBST避光洗涤3次，封片并于荧光显微镜下观察。2结果2.1MSdnaK基因的扩增以MS榆中分离株基因组DNA为模板，利用overlapPCR扩增dnaK基因，经琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小为1791bp（图1），与预期片段大小一致。2.2MSdnaK基因的序列分析将测序获得的dnaK基因序列与GenBank中部分MSdnaK序列进行比对。结果表明，与MS不同分离株的dnaK基因序列同源性高达99.4％，而与鸡毒支原体、牛支原体之间的
【参考文献】：
期刊论文
[1]牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究[J]. 张锐,杨铭伟,任静静,朱玲,柳旭伟,剡根强. 中国畜牧兽医. 2018(07)
[2]羊种布氏杆菌M5-90 DnaK的原核表达及免疫保护性研究[J]. 张俊波,印双红,易继海,张红,方维焕,王嘉福,李志强,陈创夫. 中国兽医科学. 2018(08)
[3]滑液支原体WVU1853株免疫相关膜蛋白的初步分析[J]. 包世俊,丁小琴,邢小勇,伏小平,薛慧文,温峰琴. 畜牧兽医学报. 2017(02)
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[5]猪肺炎支原体168弱毒菌株P65-DnaKc融合蛋白的表达及免疫原性[J]. 刘思远,刘东,关婉怡,鞠建松,赵宝华. 中国兽医学报. 2015(09)
[6]志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70（DnaK）多克隆抗体的制备和鉴定[J]. 王羽,周围,廖翔,岳俊杰,宋婷,戴红梅,陈欣欣,梁龙,呼和巴特尔. 细胞与分子免疫学杂志. 2015(01)
[7]绵羊肺炎支原体DnaK B细胞抗原表位预测及其蛋白结构分析[J]. 王慧,罗成波,贺纛,孔令萍,周碧君,文明,程振涛,王开功. 生物技术通报. 2014(03)
[8]牛支原体膜蛋白6种提取方法的比较研究[J]. 陈忠琼,范媛,周蓓,蒋勇,张利,黎晓敏. 中国兽医学报. 2013(06)
[9]鸡毒支原体醛缩酶的原核表达及膜定位鉴定[J]. 何随彬,谭磊,包世俊,郭小琴,仇旭升,宋翠萍,费荣梅,丁铲. 中国兽医科学. 2013(01)
[10]猪肺炎支原体中国分离株热休克蛋白Hsp70（Dnak）的全基因克隆及C末端基因的表达与免疫活性分析[J]. 李媛,张建华,王亮,乔祖建,辛九庆. 中国预防兽医学报. 2008(03)
本文编号：3547163
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