猪DC-SIGN真核表达载体构建及介导PEDV感染作用的初步验证

发布时间：2017-05-10 12:13

  本文关键词：猪DC-SIGN真核表达载体构建及介导PEDV感染作用的初步验证，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水为主要特征的一种肠道传染病,对哺乳仔猪致死率可达100%。自2010年末开始,PED在我国大部分省市和地区出现了爆发,给养猪业带来巨大的经济损失。因此,开展PEDV感染机制相关的基础研究具有现实意义和紧迫性。C型凝集素DC-SIGN是树突状细胞表面特异性表达的一种多功能蛋白分子,在PEDV同属的SARS冠状病毒(SARS-CoV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)和人冠状病毒229E(HCoV-229E)感染过程中发挥重要作用。由此可见,猪DC-SIGN在PEDV感染中作用的探索研究,能为PEDV感染机理的解析提供基础信息。为了获得猪DC-SIGN单因子血清,本研究根据Genbank发表的人DC-SIGN核苷酸序列(EU684956),按照大肠杆菌密码子偏爱性,人工合成了猪DC-SIGN基因(pDC-SIGN),并在5'端和3'端分别引入BamHI和XhoI酶切位点。pDC-SIGN基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1后,在大肠杆菌E.coli BL21中获得了成功表达。利用纯化的pDC-SIGN重组蛋白免疫BALB/c鼠,制备了pDC-SIGN重组蛋白单因子血清。Western blot结果显示,pDC-SIGN重组蛋白单因子血清能够识别猪小肠黏膜上皮细胞(IEC)、猪睾丸细胞(ST)、猪肾细胞(PK15)和仔猪小肠组织中天然的猪DC-SIGN,可用于后续pDC-SIGN的检测。为了构建pDC-SIGN真核表达载体,本研究根据真核宿主细胞密码子的偏爱性,人工合成了pDC-SIGN基因(pSIGN),并在5'端和3'端分别引入EcoRI和XhoI酶切位点。免疫荧光试验和Western blot试验证明,合成的pSIGN基因瞬时转染PEDV非敏感细胞中国仓鼠卵巢细胞(CHO)后,获得了成功表达。病毒感染细胞计数试验显示,表达pSIGN的CHO细胞,在PEDV感染后12h、24h、36h和48h,感染细胞数显著高于对照组(p0.05)。本研究制备了pDC-SIGN单因子血清,构建了pDC-SIGN真核表达载体,初步验证pDC-SIGN在CHO细胞中过表达能增加PEDV感染的细胞数,为pDC-SIGN在PEDV感染中作用深入的研究提供了物质基础。
【关键词】：PEDV 猪DC-SIGN 单因子血清 过表达
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要4-5
• abstract5-10
• 第一章 文献综述10-20
• 1.1 PEDV概述10-11
• 1.1.1 PEDV基因组结构10
• 1.1.2 PEDV结构蛋白功能10-11
• 1.1.3 PEDV分子流行病学11
• 1.2 PEDV受体及感染相关蛋白研究进展11-14
• 1.2.1 猪氨基肽酶N作为猪冠状病毒细胞受体研究进展12-13
• 1.2.2 PEDV其他感染相关蛋白研究进展13-14
• 1.3 DC-SIGN在冠状病毒感染中的作用14-18
• 1.3.1 DC-SIGN的结构与表达14-16
• 1.3.2 DC-SIGN在冠状病毒感染中作用研究进展16-18
• 1.4 本研究目的意义18-20
• 第二章 猪DC-SIGN基因原核表达及其单因子血清的制备20-32
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 质粒、载体及菌种20
• 2.1.2 主要生化试剂及试验动物20
• 2.1.3 主要仪器设备20-21
• 2.2 方法21-27
• 2.2.1 pDC-SIGN基因的合成21
• 2.2.2 pDC-SIGN基因鉴定引物的设计21-22
• 2.2.3 pDC-SIGN基因原核表达与纯化22-25
• 2.2.4 重组蛋白pDC-SIGN的Western blot分析25-26
• 2.2.5 重组蛋白pDC-SIGN单因子血清的制备26-27
• 2.2.6 重组蛋白pDC-SIGN单因子血清的鉴定27
• 2.3 结果27-31
• 2.3.1 pDC-SIGN基因表达与纯化27-30
• 2.3.2 重组蛋白pDC-SIGN的Western blot分析30
• 2.3.3 重组蛋白pDC-SIGN单因子血清Western blot分析30-31
• 2.4 讨论31
• 2.5 小结31-32
• 第三章 猪DC-SIGN基因真核表达载体构建及介导PEDV感染作用的初步验证32-52
• 3.1 材料32-33
• 3.1.1 质粒、病毒和细胞32
• 3.1.2 主要生化试剂32
• 3.1.3 仪器设备32-33
• 3.2 方法33-37
• 3.2.1 猪DC-SIGN真核表达载体构建与鉴定33-34
• 3.2.2 重组质粒瞬时转染CHO细胞系及鉴定34-36
• 3.2.3 重组质粒介导PEDV入侵CHO细胞的初步研究36-37
• 3.3 结果37-50
• 3.3.1 重组真核表达质粒PCR鉴定结果37
• 3.3.2 重组真核表达质粒免疫荧光鉴定结果37-38
• 3.3.3 重组真核表达质粒Western blot鉴定38-39
• 3.3.4 PEDV感染表达pDC-SIGN CHO细胞 12 h结果39-41
• 3.3.5 PEDV感染表达pDC-SIGN CHO细胞 24h结果41-43
• 3.3.6 PEDV感染表达pDC-SIGN CHO细胞 36 h结果43-45
• 3.3.7 PEDV感染表达pDC-SIGN CHO细胞 48 h结果45-47
• 3.3.8 PEDV感染表达pDC-SIGN CHO细胞 60 h结果47-50
• 3.3.9 数据分析50
• 3.4 讨论50-51
• 3.5 小结51-52
• 第四章 全文结论52-54
• 参考文献54-60
• 附录60-64
• 致谢64-66
• 个人简历66-67

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