猪肌纤维类型关键基因筛选及miR-423-5p的功能研究

发布时间：2017-05-10 13:00

  本文关键词：猪肌纤维类型关键基因筛选及miR-423-5p的功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着研究的不断发展,在转录组水平的分析能够更加精确的鉴定基因的结构和功能,RNA-seq深度测序技术的应用能够显著促进人们对转录组的认识。然而,关于猪不同类型肌肉的形成机制和基因调控的深度分析尚未完全揭示。因此,为全面解析不同类型肌肉中的基因表达模式和作用机制,本实验构建了猪不同类型肌肉组织的基因表达文库,采用RNA-seq技术检测两个文库中的基因表达谱,对其功能进行聚类,Pathway分析,调控网络构建,并进行了新转录本预测、基因结构优化、可变剪切分析以及SNP分析。本研究通过对不同类型肌肉转录组文库分析发现,基因SUFU在不同类型肌肉中存在差异表达,但其在肌肉发育中的具体调控机制仍旧不明确。为验证SUFU在肌肉发育中的作用,我们检测了SUFU在不同组织中的表达以及肌细胞增殖和分化中的时序分析,利用RNA干扰技术探索其对于肌细胞增殖分化中的作用。生物信息分析显示,SUFU的3’UTR区域存在miR-423-5p的结合位点。作为调控SUFU的靶定mi RNA,miR-423-5p在肌肉中的作用机制并未深入了解。为了研究mi R-423-5p在成肌细胞增殖分化中的调控机制,我们首先利用实时定量PCR进行了表达谱检测以及增殖和分化过程中的表达时序分析,接着利用Agomir进行超表达处理,研究mi R-423-5p在成肌细胞增殖和分化中的作用,进一步完善miR-423-5p在肌肉发育中的调控机制。上述研究获得以下主要结果:1.在趾长伸肌(EDL)和比目鱼肌(Sol)文库中分别获得89658562和46723568条原始序列,通过比对分析鉴定出16415和16017个参考基因。2.EDL和Sol文库中筛选出2152个差异表达基因,其中1534个上调以及618个下调;在EDL和Sol组中的细胞功能、分子组分以及生物学过程中共有1442、1481和1526个基因比对到一个或多个GO条目中。3.在不同肌肉组织中的差异表达基因总共富集到241条信号通路,分别有230和216条通路受到上调和下调的影响。RNA-seq测序结果中选取了57个肌肉相关基因进行分析,其中22个基因的表达水平差异并不显著。筛选了其中18个差异表达基因进行蛋白互作网络构建,发现其调控的靶位点大部分存在表达量的上下调差异;在EDL组中3271个转录本在5’端优化,1559个转录本在3’端优化;在Sol组中,2814个转录本在5’端优化,1385个转录本在3’端优化;EDL组和Sol组分析中分别发现了10962和9686个新转录本,9334和8585个可变剪切事件,以及58362和58395个潜在的SNP位点。4.SUFU在小鼠不同组织中广泛表达,其中在EDL和Sol组织中存在差异且与测序所得数据相符;SUFU在成肌细胞的增殖和分化过程中,均呈现出先上升后下降的趋势;干扰SUFU能够抑制C2C12成肌细胞的增殖和分化。5.mi R-423-5p作为SUFU的潜在靶定mi RNA,在小鼠的不同组织中广泛表达;在C2C12细胞增殖过程中,miR-423-5p的表达量前期上升至顶峰,之后逐渐降低至平稳表达。超表达mi R-423-5p能够抑制肌细胞增殖,并抑制细胞的分裂水平。6.mi R-423-5p的表达量随着C2C12细胞分化逐渐上升,在分化的后期时达到顶峰,然后逐渐下降;超表达miR-423-5p能够抑制C2C12细胞分化,并且抑制肌管形成。综上,本研究获得了高质量的猪不同类型肌肉组织的转录组数据,鉴定并研究了差异表达基因SUFU及其靶定的miR-423-5p,为肌肉发育和肌纤维类型的调控机制提供了更加深入的认识。
【关键词】：猪 肌纤维类型 高通量测序 差异基因 miRNA
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 文献综述14-26
• 1.1 骨骼肌研究进展14-18
• 1.1.1 骨骼肌发育14-16
• 1.1.2 肌纤维类型16-18
• 1.1.3 肌纤维类型与肉质18
• 1.2 转录组测序研究进展18-21
• 1.2.1 RNA-seq原理19
• 1.2.2 RNA-seq测序平台19-20
• 1.2.3 RNA-seq的生物信息学分析20-21
• 1.2.4 RNA-seq在猪育种中的应用21
• 1.3 miRNA研究进展21-24
• 1.3.1 miRNA的生成22
• 1.3.2 miRNA作用机制22-23
• 1.3.3 miRNA在骨骼肌发育中的作用23-24
• 1.3.4 miRNA在肌纤维类型中的作用24
• 1.4 本研究的目的和意义24-26
• 第二章 猪不同肌纤维转录组文库构建和高通量测序26-34
• 2.1 材料及方法26-28
• 2.1.1 实验动物及样品采集26
• 2.1.2 仪器和设备26
• 2.1.3 试剂26
• 2.1.4 实验方法26-28
• 2.2 结果与分析28-32
• 2.2.1 测序质量评估28-30
• 2.2.2 参考序列比对30-32
• 2.3 讨论32-33
• 2.4 小结33-34
• 第三章 猪不同肌肉组织文库差异基因筛选及注释34-41
• 3.1 材料与方法34-36
• 3.1.1 基因比对分析34
• 3.1.2 差异基因筛选与注释34-35
• 3.1.3 基因结构优化35
• 3.1.4 新转录本预测和注释35
• 3.1.5 可变剪切35
• 3.1.6 SNP分析35-36
• 3.2 结果与分析36-39
• 3.2.1 基因比对统计36
• 3.2.2 差异基因筛选36-37
• 3.2.3 基因结构优化37
• 3.2.4 新转录本预测和注释37
• 3.2.5 可变剪切分析37-38
• 3.2.6 SNP分析38-39
• 3.3 讨论39-40
• 3.4 小结40-41
• 第四章 猪不同肌肉组织转录组数据深度挖掘41-53
• 4.1 材料与方法41-42
• 4.1.1 GO功能显著性富集分析41-42
• 4.1.2 Pathway显著性富集分析42
• 4.1.3 蛋白互作网络构建42
• 4.2 结果与分析42-51
• 4.2.1 猪不同类型肌肉组织的GO功能分析42-43
• 4.2.2 不同肌肉组织中的差异基因通路分析43-44
• 4.2.3 肌肉相关基因的鉴定和筛选44-46
• 4.2.4 蛋白互作网络构建46-47
• 4.2.5 猪不同肌肉组织差异基因在肌纤维相关的Pathway分析47-51
• 4.3 讨论51
• 4.4 小结51-53
• 第五章 基因SUFU在成肌细胞增殖分化中的作用53-59
• 5.1 材料和方法53-54
• 5.1.1 实验动物及细胞53
• 5.1.2 实验试剂53
• 5.1.3 小鼠组织样品采集53
• 5.1.4 C2C12成肌细胞培养及转染53-54
• 5.1.5 组织或细胞总RNA提取54
• 5.1.6 RT-qPCR检测SUFU及相关标志基因表达54
• 5.1.7 数据分析54
• 5.2 结果与分析54-57
• 5.2.1 SUFU基因在小鼠中的组织表达谱54-55
• 5.2.2 SUFU基因在成肌细胞增殖和分化过程中的时序表达55
• 5.2.3 SUFU基因的siRNA干扰效率检测55-56
• 5.2.4 干扰SUFU对成肌细胞增殖的作用56
• 5.2.5 干扰SUFU对成肌细胞分化的作用56-57
• 5.3 讨论57-58
• 5.4 小结58-59
• 第六章 过表达miR4235P抑制C2C12成肌细胞增殖59-66
• 6.1 材料与方法59-61
• 6.1.1 实验试剂和仪器59
• 6.1.2 实验动物及细胞59
• 6.1.3 细胞培养及转染59-60
• 6.1.4 细胞总RNA提取60
• 6.1.5 实时定量PCR检测60
• 6.1.6 蛋白免疫印记60
• 6.1.7 EdU检测60
• 6.1.8 流式细胞分析60
• 6.1.9 CCK-8 检测60-61
• 6.1.10 数据分析61
• 6.2 结果与分析61-64
• 6.2.1 mi R4235p的组织表达谱61
• 6.2.2 mi R4235p在C2C12成肌细胞增殖中的时序表达61-62
• 6.2.3 转染miR4235p的Agomir后超表达效率检测62
• 6.2.4 过表达miR4235p抑制细胞周期基因的mRNA和蛋白表达水平62-63
• 6.2.5 过表达miR4235p抑制细胞增殖63-64
• 6.3 讨论64-65
• 6.4 小结65-66
• 第七章 过表达miR4235P抑制C2C12成肌细胞分化66-72
• 7.1 材料与方法66-67
• 7.1.1 实验试剂和仪器66
• 7.1.2 细胞培养及转染66
• 7.1.3 实时定量PCR66
• 7.1.4 蛋白免疫印记66
• 7.1.5 免疫荧光检测肌管形成66-67
• 7.1.6 数据统计分析67
• 7.2 结果与分析67-70
• 7.2.1 mi R4235p在C2C12成肌细胞分化中的时序表达67
• 7.2.2 转染miR4235p后超表达效率检测67-68
• 7.2.3 超表达miR4235p抑制成肌分化标志基因的mRNA和蛋白表达68-69
• 7.2.4 超表达miR4235p抑制肌管的形成69-70
• 7.3 讨论70-71
• 7.4 小结71-72
• 结论72-73
• 创新点73-74
• 进一步研究内容74-75
• 参考文献75-81
• 附录81-89
• 致谢89-90
• 作者简介90

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