犬狂犬病病毒抗体液态芯片检测方法研究

发布时间：2017-05-10 13:02

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【摘要】：狂犬病是由亲神经性狂犬病病毒引起的一种高度致死性人兽共患病,几乎可以感染所有的温血脊椎动物,病死率约为100%。对于宠物犬和普通实验犬而言,需定期检测血清中狂犬病病毒抗体水平,从而进行感染监测和免疫效果评价,而无特定病原体实验犬狂犬病病毒抗体要求必须为阴性。目前,常规的检测狂犬病血清抗体水平的方法均无法实现狂犬病与其他犬常见病毒性传染病的同时检测。液态芯片是一种新型的高通量检测技术,可以对同一样品中多种不同生物分子进行检测,与多种病原体或抗体分别检测相比,不仅节省了很多时间,而且大大提高了样品的利用率。本研究通过狂犬病病毒糖蛋白的表达和B细胞线性抗原表位预测及合成两种途径制备狂犬病病毒糖蛋白人工抗原。狂犬病病毒糖蛋白基因工程抗原的制备采用昆虫杆状病毒表达系统:利用RT-PCR方法扩增糖蛋白基因,亚克隆至p MD18-T载体,经PCR和测序鉴定后,成功构建了重组克隆质粒p MD18T-SRV9G;将SRV9G基因再次克隆到p Fast Bac Dual质粒上,经PCR、酶切及测序鉴定后,成功构建了重组供体质粒p Fast Bac Dual-SRV9G;重组供体质粒转化DH10Bac感受态细胞,挑取白色克隆进行PCR鉴定,结果表明成功构建了重组穿梭质粒Bacmid-SRV9G;鉴定正确的重组穿梭质粒转染Sf9细胞,观察细胞病变,收获并扩增重组杆状病毒,并对其进行负染电镜观察,结果表明重组杆状病毒转染成功;通过SDS-PAGE和Western blot检测重组杆状病毒的表达,结果显示Sf9细胞成功表达了狂犬病病毒糖蛋白。狂犬病病毒糖蛋白抗原表位预测:通过对糖蛋白的基本性质和二级结构分析,结合DNAStar、在线分析工具Bepipred和ABCpred预测得到8段可能性较大的B细胞线性抗原表位,筛选部分序列后合成,用于液态芯片方法的建立。本研究将狂犬病病毒糖蛋白及其B细胞线性抗原表位TG16-1、TG16-2、GS-12、DG-14分别偶联到磁性羧基微球上制备捕获微球,检测相同的阴性和阳性血清进行评价。初步筛选出用于液态芯片检测的抗原为狂犬病病毒糖蛋白和表位多肽TG16-1。将表位多肽TG16-1分别偶联到磁性荧光微球和聚苯乙烯荧光微球制备捕获微球,检测相同的血清,结果发现聚苯乙烯荧光微球效果比磁性荧光微球效果好。以巯基聚苯乙烯微球为载体,分别偶联狂犬病病毒糖蛋白和表位多肽TG16-1,制备了两种不同的捕获微球。对检测过程中两种不同的捕获微球用量、PE标记羊抗犬Ig G浓度、血清孵育时间及PE标记羊抗犬Ig G孵育时间进行了优化。优化结果为:狂犬病病毒糖蛋白和表位多肽TG16-1的捕获微球用量均为1μL,PE标记羊抗犬Ig G反应浓度分别为8μg/m L和4μg/m L,血清孵育时间分别为2 h和1 h,PE标记羊抗犬Ig G孵育时间分别为1h和0.5 h。因表位多肽易合成,纯度高,利于成果转化,最终确定检测抗原为表位多肽TG16-1。对犬狂犬病病毒抗体液态芯片检测方法进行特异性和敏感性评价,犬狂犬病病毒抗体液态芯片与犬瘟热、犬细小、犬传染性肝炎阳性血清均无交叉反应;抗体效价最低检测限为0.41 IU/m L。本研究成功建立了犬狂犬病病毒抗体液态芯片检测方法,该方法特异性强,敏感性高,为犬主要病毒性传染病高通量快速检测试剂盒的研发奠定了基础。
【关键词】：狂犬病病毒糖蛋白 杆状病毒表达 B细胞线性抗原表位预测 液态芯片
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩写词表11-12
• 引言12-13
• 第一篇 文献综述13-28
• 第1章 重组蛋白表达系统的研究进展13-22
• 1 原核表达系统13-14
• 2 酵母表达系统14-16
• 3 昆虫细胞表达系统16-18
• 4 哺乳动物细胞表达系统18-20
• 5 无细胞表达系统20-22
• 第2章 狂犬病的诊断与监测技术22-28
• 1 直接快速免疫组化试验22-23
• 2 快速免疫层析试验23
• 3 实时荧光定量PCR23-24
• 4 系统发生生物地理学分析24-25
• 5 蛋白质组学分析25-26
• 6 液态芯片检测技术26-28
• 第二篇 研究内容28-71
• 第1章 狂犬病病毒糖蛋白人工抗原的制备28-57
• 1.1 材料28-31
• 1.2 方法31-43
• 1.3 结果43-53
• 1.4 讨论53-55
• 1.5 小结55-57
• 第2章 狂犬病病毒抗体液态芯片检测方法的建立57-71
• 2.1 材料58-59
• 2.2 方法59-63
• 2.3 结果63-68
• 2.4 讨论68-70
• 2.5 小结70-71
• 结论71-72
• 参考文献72-83
• 导师简介83-84
• 作者简介84-85
• 致谢85-86

【参考文献】

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本文编号：354781