新型鸭呼肠孤病毒σC基因在昆虫细胞中的表达及其免疫原性的初步研究

发布时间：2021-12-24 06:08

　　近年来,我国水禽的呼肠孤病毒感染不断发生,并逐渐呈流行趋势,严重影响了水禽业的健康发展。1997年我国番鸭出现以软脚、腹泻、肝白色坏死为主要特征的番鸭肝白点病,2005年出现以心：脾、肝、法氏囊等多器官出血／坏死为主要特征的鸭坏死性肝炎,证明其其病原均为禽呼肠孤病毒（Avianreo virus, ARV）。研究表明,禽呼肠孤病毒感染无论从流行病学、临床症状和病理变化,以及病毒生物学特性、基因组片段特征和序列同源性等方面均发生了变化。本实验室从太湖发病鸭厂的病鸭组织中分离了一株病毒,经证明其为新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）,将该病毒命名为新型鸭呼肠孤病毒太湖2011株（NDRV TH11）。σ C蛋白为禽呼肠孤病毒的吸附蛋白,能刺激机体产生特异性中和抗体,aC蛋白还能够与呼肠孤病毒竞争性的吸附细胞,吸附后可阻断病毒对细胞的吸附,所以以aC蛋白制备的基因工程苗具有良好的免疫保护性。本研究制备了NDRVσC蛋白的兔源多克隆抗体,构建重组杆状病毒BV-σC,并对表达的aC蛋白进行疫原性检测和动物试验。主要研究内容如下：1、NDRVσC蛋白的原核表达及多克... 

【文章来源】：安徽农业大学安徽省

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文缩略表
文献综述
1 引言
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 载体、细胞、病毒株及实验动物
        2.1.2 主试剂与试剂盒
        2.1.3 主要溶液及培养基的配制
        2.1.4 主要仪器
    2.2 方法
        2.2.1 NDRV σC蛋白多克隆抗体的制备
            2.2.1.1 引物设计与合成
            2.2.1.2 σC基因的扩增与表达载体的构建
            2.2.1.3 重组蛋白的诱导表达
            2.2.1.4 重组蛋白的纯化及反应原性检测
            2.2.1.5 多克隆抗体的制备及其效价测定
            2.2.1.6 多克隆抗体IFA检测
        2.2.2 σC基因重组转移载体的构建
            2.2.2.1 引物设计及合成
            2.2.2.2 σC基因的克隆
            2.2.2.3 σC基因的PCR产物的回收纯化
            2.2.2.4 σC基因片段和pFastBac~(TM)1质粒的双酶切
            2.2.2.5 σC基因片段和pFastBac~(TM)1的连接
            2.2.2.6 转化DH5α感受态细胞
            2.2.2.7 克隆质粒的挑选与鉴定
            2.2.2.8 重组质粒的提取
            2.2.2.9 重组pF-σC质粒的PCR鉴定
            2.2.2.10 重组pF-σC质粒的序列分析鉴定
        2.2.3 重组质粒的转座(即重组Bacmid的构建)
            2.2.3.1 DH10Bac感受态制作
            2.2.3.2 重组穿梭质粒的制备
            2.2.3.3 重组Bacmid DNA的提取及鉴定
        2.2.4 重组Bacmid转染sf9昆虫细胞及收获重组杆状病毒
            2.2.4.1 重组Bacmid转染sf9昆虫细胞
            2.2.4.2 扩增P1代病毒原液
            2.2.4.3 噬斑测定病毒滴度
            2.2.4.4 σC在sf9昆虫细胞中的表达
        2.2.5 sf9昆虫细胞表达蛋白的鉴定
            2.2.5.1 SDS-PAGE蛋白质电泳分析
            2.2.5.2 SDS-PAGE蛋白质样品的制备
            2.2.5.3 SDS-PAGE
            2.2.5.4 IFA鉴定
            2.2.5.5 Western blot鉴定
        2.2.6 油乳剂疫苗的制备
        2.2.7 动物免疫
        2.2.8 重组杆状病毒在小鼠体内诱导的免疫原性评价
            2.2.8.1 ELISA方法检测抗体水平
            2.2.8.2 病毒中和抗体检测结果
        2.2.9 攻毒保护性试验
3 结果与分析
    3.1 NDRV 6C蛋白多克隆抗体的制备
        3.1.1 σC基因的克隆与表达载体的构建
        3.1.2 aC蛋白表达与纯化
        3.1.3 多克隆抗体制备及其效价检测
        3.1.4 多克隆抗体的特异性检测
    3.2 重组载体鉴定结果
    3.3 重组Bacmid的筛选与鉴定
    3.4 σC蛋白在sf9昆虫细胞中的表达
        3.4.1 重组杆状病毒的细胞病变观察
        3.4.2 表达产物的SDS-PAGE检测
        3.4.3 表达产物的IFA检测
        3.4.4 Western-blot检测
    3.5 重组杆状病毒在樱桃谷肉鸭体内诱导的免疫原性评价
        3.5.1 ELISA检测结果
        3.5.2 病毒中和抗体检测结果
    3.6 攻毒保护性试验
4 讨论
5 结论
参考文献


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3549954