禽呼肠孤病毒p17非结构蛋白调控c-myc基因表达的信号通路研究

发布时间：2017-05-11 04:11

  本文关键词：禽呼肠孤病毒p17非结构蛋白调控c-myc基因表达的信号通路研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：禽呼肠孤病毒(ARV)属于呼肠孤病毒科中的正呼肠孤病毒属,是一种重要的家禽病原体。ARV感染禽类可引起多种疾病并且会导致严重的经济损失,常见的有病毒性关节炎/腱鞘炎、吸收障碍综合征(MAS)、免疫抑制等疾病,但其发病机制仍了解甚少。ARV非结构蛋白p17可以参与细胞核中一些反应过程,如基因转录、DNA结合、细胞生长调节、细胞的自噬,细胞周期调节等。c-myc基因基因家族属于癌基因中的核蛋白类调控基因,在细胞增殖、永生化、去分化和诱导凋亡等多方面起到调节作用。实验室初次发现非结构蛋白p17对c-myc基因的表达有影响,且实验室初期研究ARV非结构蛋白p17对细胞自噬,细胞周期,细胞凋亡的研究取得一定成果。本试验旨在研究ARV非结构蛋白p17对c-myc基因基因的表达调控,并进一步探究ARV非结构蛋白p17是通过哪种信号通路调控c-myc基因的表达,以及非结构蛋白p17对c-myc基因调控的信号机制,从而通过使用对此信号通路各关键点针对性的阻断剂或shRNA抑制原癌基因的表达,对ARV病毒在宿主细胞的调节提供新的研究方向,并进一步用于ARV的临床防控。1.通过冷光试验检测c-myc基因reporter在0 h,6 h,12 h,18 h和24 h的空白对照组,感染ARV组以及转染ARV非结构蛋白p17组的c-myc基因表达活性的强弱。将实验室已有重组质粒PCDNA3.1-p17与c-myc reporter质粒共转染于DF-1,Vero以及Hela细胞,同时将ARV病毒以5 MOI(1.0×108 PFU/mL)分别接入DF-1,Vero,Hela细胞,未感染ARV病毒的细胞作为空白对照组。结果表明,ARV感染组的细胞对c-myc基因活性表达有抑制效果,非结构蛋白p17对c-myc基因的表达活性抑制作用更加明显。细胞在接种ARV后6 h,12h,18 h测得的c-myc基因的活性与对照组相比并未有抑制作用,但于24h出现了抑制作用。非结构蛋白p17质粒转染细胞后6 h、12 h、18 h、24 h检测的c-myc基因活性表达持续减弱,表明了非结构蛋白p17对c-myc基因表达活性有抑制作用。2.实验室前期研究表明,ARV非结构蛋白非结构蛋白p17对AKT和mTOR有抑制作用,并且是通过ARV介导的自噬依赖的PI3K/AKT/mTOR途径。本实验利用Western Blot检测非结构蛋白p17对c-myc基因表达的抑制,结果表明p17对c-myc基因的表达抑制是通过PI3K/AKT/mTOR/FOXO1信号通路。
【关键词】：禽呼肠孤病毒 非结构蛋白p17 c-myc基因 信号通路 冷光试验
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-10
• 文献综述10-15
• 第一章 禽呼肠孤病毒（ARV）非结构蛋白p17的研究进展10-15
• 1.1 禽呼肠孤病毒（ARV）非结构蛋白的种类10-11
• 1.2 非结构蛋白p17的作用11-13
• 1.2.1 非结构蛋白p17对细胞的自噬作用11-12
• 1.2.2 非结构蛋白p17对细胞周期的作用12
• 1.2.3 非结构蛋白p17对AKT, PTEN, mTOR的作用12-13
• 1.2.4 非结构蛋白p17与c-myc基因关系13
• 1.3 本课题研究的目的和内容13-15
• 试验研究15-36
• 第二章 禽呼肠孤病毒（ARV）及其非结构蛋白p17对c-myc基因的调控作用15-23
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 细胞16
• 2.1.2 病毒，菌株和载体16
• 2.1.3 主要试剂16
• 2.1.4 主要仪器16
• 2.1.5 常用试剂配制16-17
• 2.2 方法17-19
• 2.2.1 禽呼肠孤病毒（ARV）攻毒实验17-18
• 2.2.3 c-myc基因reporter与PCDNA3.1- p17共转染实验18
• 2.2.4 禽呼肠孤病毒（ARV）及其非结构蛋白p17对c-myc基因的作用18-19
• 2.3 结果19-20
• 2.3.1 质粒的提取19
• 2.3.2 禽呼肠孤病毒（ARV）及其非结构蛋白p17对c-myc基因的作用19-20
• 2.4 讨论20-22
• 2.5 小结22-23
• 第三章 禽呼肠孤病毒（ARV）非结构蛋白p17对c-myc基因调控的信号通路研究23-36
• 3.1 材料23-24
• 3.1.1 细胞、病毒与质粒23-24
• 3.1.2 主要试剂24
• 3.1.3 主要仪器24
• 3.1.4 常用试剂的配制24
• 3.2 方法24-30
• 3.2.1 禽呼肠孤病毒（ARV） S1133疫苗株增毒实验24-25
• 3.2.2 PCDNA3.1-p17,Vector质粒转化及重提25-26
• 3.2.3 冷光试验测定InsuLion对AKT活性的影响26-27
• 3.2.4 Western Blot检测各相关蛋白量的变化27-29
• 3.2.5 免疫共沉淀实验29-30
• 3.3 结果30-34
• 3.3.1 ARV S1133疫苗株增毒实验30
• 3.3.2 胰岛素（InsuLion）对AKT的影响30-31
• 3.3.3 Western Blot检测相关蛋白量的变化及其灰度值分析31-34
• 3.4 讨论34-35
• 3.5 小结35-36
• 结论36-37
• 参考文献37-41
• 致谢41-42
• 作者简介42

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