嗜热菌β-糖苷酶基因乳腺特异性表达载体的构建、转染及鉴定

发布时间：2022-01-02 22:41

　　利用牛乳腺生物反应器产生乳糖分解酶从而生产低乳糖牛奶，是解决乳糖不耐症的一种手段，而构建高效、特异的表达载体是制备乳腺生物反应器的关键步骤。本实验将来源于古细菌的嗜热菌β-糖苷酶基因（LacS）根据牛的密码子使用频率进行了密码子优化，并合成了优化后的基因。以牛乳球蛋白（BLG）上游调控区域做为启动子，以嗜热菌β-糖苷酶（LacS）为目的基因，添加了Loxp锚定的新霉素抗性基因（Neo）和增强型绿色荧光蛋白报告基因（EGFP），构建了pLOX-EGFP-BLG-LacS载体。并且通过脂质体介导方法将重组质粒转染小鼠的乳腺癌细胞，并筛选得到单克隆。阳性单克隆通过PCR进行DNA水平的整合检测；经催乳素诱导后的阳性单克隆通过RT-PCR进行mRNA水平表达检测。研究结果如下：首先,乳腺特异表达载体的构建。通过PCR技术扩增出924bp牛β-乳球蛋白（BLG）基因5′调控序列，并与T载体连接记为pMD-19BLG，质粒大小为3.7kb。然后将其与公司优化合成的pUC57-LacS质粒，pLOX-EGFP质粒通过相应的酶切后进行连接，经基因重组后构建了乳腺特异性表达载体pLOX-EGFP-BLG... 

【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

硫矿硫化叶菌与牛基因组的氨基酸密码子使用百分比统计

图 1 硫矿硫化叶菌与牛基因组的氨基酸密码子使用百分比统计Fig.1 Codon usage frequency of sulfolobus solfataricus and bovine genome为硫矿硫化叶菌的密码子使用百分比，黑色为牛的密码子使用百分比。

在生工生物工程(上海)有限公司进行了优化后的 LacS基因以及 SV40加尾序基因合成（GN:0696），用于载体构建。合成序列结果如下：图 3 LacS 密码子优化改变碱基图Fig.3 Codon optimization results of LacS gene

【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
[1]人溶菌酶转基因山羊乳腺生物反应器的研制[D]. 刘思国.华东师范大学 2006



本文编号：3565019