抗牛病毒性腹泻病毒siRNA与miRNAs功能基因筛选与评价

发布时间：2022-01-03 01:30

　　牛病毒性腹泻病毒（bovineviraldiarrheaviruses，BVDV）是牛病毒性腹泻-粘膜病的主要抗原，该病在世界各国都有比较普遍的发生和存在。该病对我国养殖业同样构成严重危胁。因此，国内、外对BVD的防治都非常关注。但是目前针对BVDV感染尚无特异性的预防疫苗、治疗方法和抗病毒药物。因此建立新的抗病毒方法，控制病毒的扩散具有重要意义。利用转基因技术进行抗病育种已成为研究热点，而抗病候选基因的克隆和验证是转基因新品种培育中急待解决的关键问题。本研究从两个角度开展抗BVDV功能基因研究：（1）靶向病毒基因设计siRNA，抑制BVDV增殖为目的，将RNAi技术与转基因技术相结合，进行抗病毒功能基因研究，并在绵羊个体进行抗BVDV效果评价，为制备抗BVDV转基因家畜动物奠定基础；（2）以修饰宿主抗BVDV功能基因，提高BVDV易感动物的抗病性能为目的，通过microRNAs（miRNAs）的差异表达分析，筛选宿主抗BVDV功能基因，为我国抗病转基因新品种培育和产业化提供基因资源。首先，设计靶向BVD病毒Npro、C、NS3、NS4B、NS5A基因的shRNA干扰片段，构建相应的s... 

【文章来源】：石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校

【文章页数】：157 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
目录
主要缩略词
引言
第一章 文献综述
    综述一 牛病毒性腹泻病毒的研究进展
        1、BVDV概况
        2、BVDV基因组结构及功能
        3、BVDV的持续感染
    综述二 转基因动物的研究进展
        1、转基因动物制作方法
        2、转基因动物的应用前景
        3、转基因动物研究中存在的问题
    综述三 RNA干扰及其在抗病毒中的应用
        1、RNAI分子机制
        2、RNAI与MIRNA
        3、RNAI与抗病毒研究
第二章 实验研究
    实验一 高效抑制BVDV复制SHRNA干扰片段的设计及筛选
        摘要
        1 材料
            1.1 病毒和细胞
            1.2 载体和菌株
            1.3 限制性内切酶、工具酶及试剂盒
        2 方法
            2.1 靶向BVDVshRNA片段的设计及合成
            2.2 靶向BVDVshRNA干扰载体的构建
            2.3 shRNA干扰载体转染MDBK细胞
            2.4 细胞攻毒
            2.5 荧光定量PCR检测BVDVmRNA的表达
            2.6 病毒TCID50检测
        3 结果
            3.1 靶向BVDVshRNA干扰载体的构建
            3.2 shRNA干扰载体对病毒接种后细胞病变情况的影响
            3.3 荧光定量PCR检测shRNA干扰载体的抗病毒效果
            3.4 TCID50检测shRNA干扰载体的抗病毒效果
        4 讨论
            4.1 RNAi片段的选择
            4.2 双干扰片段的设计
            4.3 细胞水平抗BVDV效果评价
        5 小结
    实验二 抗BVDV转基因阳性绵羊胎儿成纤维细胞的制备
        摘要
        1 材料
            1.1 菌种及质粒
            1.2 限制性内切酶和工具酶
        2 方法
            2.1 转基因表达载体的构建
            2.2 绵羊胎儿成纤维细胞的分离
            2.3 靶向BVDV转基因表达载体pNeo-2loxp-u6-shBVDV线性化
            2.4 G-418绵羊胎儿成纤维细胞最佳筛选浓度的测定
            2.5 线性化的pNeo-2loxp-u6-shBVDV转染绵羊胚胎成纤维细胞
            2.6 细胞的筛选
            2.7 阳性细胞的鉴定
        3 结果
            3.1 转基因载体pNeo-2loxp-u6-shBVDV鉴定
            3.2 绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养
            3.3 转基因阳性细胞的获得
            3.4 阳性细胞抗病毒效果分析
        4 讨论
            4.1 绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养
            4.2 细胞转染和稳定筛选
            4.3 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的培养和鉴定
            4.4 转基因细胞对BVDV复制的抑制作用
        5 小结
    实验三 抗BVDV转基因绵羊抗病毒效果评价
        摘要
        1 材料
            1.1 实验动物
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 体细胞核移植
            2.2 胚胎移植
            2.3 妊娠诊断
            2.4 转基因绵羊外源基因整合鉴定
            2.5 shRNA在转基因绵羊中的表达分析
            2.6 细胞水平抗BVDV能力检测
        3 结果
            3.1 绵羊卵母细胞的成熟培养
            3.2 重构胚胎的体外发育
            3.3 靶向抑制BVDV复制转基因绵羊的研究
            3.4 转基因绵羊PCR鉴定
            3.5 shRNA在转基因绵羊中的表达分析
            3.6 流产胎儿成纤维细胞、肾上皮细胞的分离培养及细胞水平抗BVDV能力检测
        4 讨论
            4.1 shRNA转基因绵羊的制备
            4.2 转基因动物流产及克隆效率低
            4.3 转基因绵羊体细胞抗BVDV感染能力的初步评价
        5 小结
    实验四 MIR-1249在MDBK细胞中的抗BVDV研究
        摘要
        1 材料
            1.1 细胞、病毒
            1.2 主要试剂
        2 方法
            2.1 总体技术路线
            2.2 测序样品准备
            2.3 高通量测序
            2.4 凋亡相关microRNA预测及分析
            2.5 microrRNA的验证
            2.6 miR-1249功能分析(凋亡检测)
            2.7 miR-1249靶点验证
        3 结果
            3.1 建立病毒感染miRNA表达谱
            3.2 差异表达miRNAs筛选及鉴定
            3.3 miR-1249表达验证
            3.4 miR-1249功能研究
            3.5 miR-1249靶基因研究
        4 讨论
            4.1 miR-1249功能研究
            4.2 miR-1249作用靶点分析
            4.3 Bcl-2蛋白表达量分析
            4.4 miR-1249靶基因调节细胞凋亡的分子机制
            4.5 抗BVDV转基因绵羊抗病育种新思路
        5 小结
第三章 全文结论与创新点
    全文结论
    创新点
参考文献
附录
    附件（一） 实验一技术路线
    附件（二） 实验二技术路线
    附件（三） 实验三技术路线
    附件（四） 实验四技术路线
致谢
个人简历
导师评阅表



本文编号：3565289